Литература

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 87, 98-108.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 129-137.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 78-86, 100.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 122-137.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 129-145, 157-159.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 92-102.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 73-77, 81-84.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 36-43.

9. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

10. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 84-88.

Занятие 4

Тема: Регуляция ферментативных процессов. Ингибиторы и активаторы ферментов. Медицинская энзимология. Количественное определение активности α-амилазы и лактатдегидрогеназы в сыворотке крови.

Актуальность. Достижения энзимологии (науки о ферментах) широко внедряются в медицину. Развитие медицинской энзимологии происходит по трем главным направлениям (энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия), что позволяет решать проблемы патогенеза энзимопатий, применять ферментные тесты для диагностики органических и функциональных нарушений органов и тканей, а также использовать ферменты и модуляторы их действия как лекарственные препараты. Так, повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови наблю-дается при рахите, опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механичес-кой желтухе, вирусном гепатите, а снижение - при гипотериозе, гиповита-минозе С и др. Активность лактатдегидрогеназы повышается у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолях, остром гепатите. Ферменты используются как лечебные препа-раты (пепсин, трипсин, гиалуронидаза), как аналитические реактивы в клинико-биохимических лабораториях (глюкозооксидаза, уреаза и др.).

Цель. Выучить и уметь анализировать механизмы регуляции ферментативных процессов как основы обмена веществ в организме в норме и при патологиях, изменение их протекания при наследственных и приобретённых энзимопатиях. Ознакомиться с активаторами и ингибиторами ферментов, типами ингибирования. Рассмотреть основные аспекты энзимодиагностики и энзимотерапии. Ознакомиться с методами количественного определения активности α-амилазы и лактатдегидрогеназы сыворотки крови и их клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Регуляция ферментативных процессов, пути и механизмы: аллостерические взаимодействия, ковалентная модификация ферментов, действие регуляторных белков-эффекторов (кальмодулина, протеиназ, протеиназных ингибиторов). Циклические нуклеотиды как регуляторы ферментативных реакций и биологических функций клетки.

2. Ингибиторы и активаторы ферментов. Типы ингибирования ферментов: обратимое (конкурентное и неконкурентное) и необратимое. Примеры.

3. Основные аспекты современной энзимодиагностики. Индикатор-ные, секреторные и экскреторные ферменты. Изоферменты в энзимодиагностике, тканевая специфичность распределения изоферментов. Изменения активности ферментов плазмы и сыворотки крови как диагностические показатели развития патологических процессов в органах и тканях.

4. Нарушение протекания ферментативных процессов: наследственные и приобретенные энзимопатии, врожденные недостатки метаболизма, их клинико-лабораторная диагностика.

5. Энзимотерапия – использование ферментов как лекарственных препаратов. Фармакологическое применение ферментов желудочно-ки-шечного тракта, свертывающей и фибринолитической систем крови, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем. Ингибиторы ферментов как лекарственные препараты.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Укажите активатор амилазы слюны.

А. Хлорид натрия.	С. Сульфат меди.	Е. Глюконат кальция.
В. Сульфат аммония.	D. Хлорид магния.

2. Укажите тип ингибирования, при котором ингибитором фермента является продукт реакции.

А. Конкурентное.	С. Бесконкурентное.	Е. Ретроингибирование.
В. Неконкурентное.	D. Стереохимическое

3. Укажите фермент, активность которого следует определять в моче пациента при остром панкреатите.

А. Амилаза.	D. Лейцинаминопептидаза.
В. Протеинкиназа.	Е. Щелочная фосфатаза.
С. Холинэстераза.

4. Укажите патологию, при которой активность амилазы крови возрастает в 10 и более раз:

А. Вирусный гепатит.	D. Инфаркт миокарда.
В. Острый панкреатит.	Е. Сахарный диабет.
С. Хронический холецистит.

5. Назовите фермент, активность которого определяют в плазме крови пациентов с патологией костной ткани.

А. Пепсин.	С. Амилаза.	Е.Щелочная фосфатаза.
В. Трипсин.	D. Кислая фосфатаза.

6. Для оценки степени поражения паренхимы печени у пациентов определяют:

А. Концентрацию изоформ ЛДГ₁ и ЛДГ₂ плазмы крови.

В. Концентрацию изоформ ЛДГ₄ и ЛДГ₅ плазмы крови.

С. Активность амилазы мочи.

D. Активность кислой фосфатазы.

Е. Концентрацию изоформы ЛДГ₃ плазмы крови.

7. Укажите изоформы ЛДГ, концентрация которых увеличивается в плазме крови пациентов с инфарктом миокарда:

А. ЛДГ1 и ЛДГ2.	С. Только ЛДГ3.	Е. Только ЛДГ5.
В. ЛДГ3 и ЛДГ4.	D. ЛДГ4 и ЛДГ5.

8. Назовите фермент плазмы крови, который используют в терапевтической практике для снижения кровяного давления.

А.Изоформа ЛДГ1.	С. Химотрипсин.	Е. Калликреин.
В. Трипсин.	D. Холинэстераза.

9. Какой механизм ингибирования синтеза фолиевой кислоты сульфаниламидными препаратами?

А. Конкурентный.	D. Неконкурентный.
В. Необратимый.	Е. Связывание с аллостерически- ми центрами ферментов.
С. Денатурация фермента.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Количественное определение активности α-амилазы

в сыворотке крови методом Каравея

Задание. Определить активность α-амилазы в сыворотке крови методом Каравея.

Принцип метода. α-Амилаза (α-1,4-глюканогидролаза; КФ 3.2.1.1) катализирует гидролитическое расщепление крахмала с образованием ко-нечных продуктов, не дающих окраски с йодом. Об активности фермента судят по избытку крахмала, который определяют спектрофотометрическим методом по изменению окрашивания йод-крахмального раствора.

Реактивы: 1) Субстратно-буферный раствор (рН 7,0): 26,6 г натрия гидрогенфосфата; 8,6 г бензоатной кислоты растворяют в 500 мл дистиллированной воды, доводят до кипения; 0,4 г крахмала растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и вливают в кипящий раствор. Кипятят в течение 1 мин, после охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1 литра. 2) Основной раствор йода – 0,1 ммоль/л: 3,567 г калия йодата и 45 г калия йодида - растворяют в 800 мл дистиллированной воды, прибавляют 9 мл концентрированной хлоридной кислоты и доводят объем до 1 литра дистиллированной водой. 3) Рабочий раствор йода – 0,01 ммоль/л: 50 г феррум йодида, 100 мл основного раствора йода; доводят объем до 1 литра дистиллированной водой.

Ход работы. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови провести по следующей схеме:

Хими-ческая посуда	Объем пипетки, мл	Реактивы	Проба, мл	Контроль, мл	Этапы
Химии-ческие пробирки	1	субстратно-буферный раствор	1	1	пред- инкубация
	инкубировать 5 минут при температуре 37°С
	0,1	сыворотка крови	0,02	-
	смешать, инкубировать на протяжении 7,5 минут при температуре 37°С (ферментативная реакция)
	1	рабочий раствор йода	1	1	цветная реакция
	0,1	сыворотка крови	-	0,02
		Дист. вода	до 10	до 10
	смешать, измерить Епр и Ек при длине волны 630-690 нм в кювете (10 мм) против дистиллированной воды на протяжении 5 минут (фотометрия)

Активность α-амилазы (Х) в г/(л∙ч) в сыворотке крови рассчитать по формуле:

Х = × 160×К,

где Ек – экстинкция контроля, Епр – экстинкция пробы, 160 – коэффициент расчета, учитывающий количество крахмала в пробе и контроле на 1 л биологической жидкости за 1 час инкубации при температуре 37°С; К – коэффициент разбавления исследуемой сыворотки крови.

Клинико-диагностическое значение. В норме активность α-амилазы в сыворотке крови составляет 12-32 г/(ч∙л). При заболеваниях поджелудочной железы наблюдают повышение активности α-амилазы в крови и моче. При остром панкреатите активность α-амилазы повышается в 10-30 раз, становится максимальной в первые сутки болезни, а на 2-6 сутки - быстро нормализуется. Гиперамилаземия также наблюдается при остром аппендиците, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки, холецистите, разрыве желчного пузыря, ожогах, травматическом шоке, пневмонии, простатите, уремии. Повышению активности α-амилазы способствуют лекарственные препараты (кортикостероиды, катехоламины, фуросемид, антикоагулянты), наркотики, алкоголь. Снижение активности наблюдают при гепатите, циррозе, злокачественных новообразованиях печени, сахарном диабете, гипотиреозе, кахексии.

Количественное определение активности лактатдегидрогеназы

(КФ 1.1.1.27) в сыворотке крови по Севелу и Товареку

Задание. Определить активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови по методу Севела и Товарека.

Принцип метода. Под влиянием ЛДГ L-лактат в присутствии никотинамидадениндинуклеотида (НАД) окисляется в пируват. Количество образовавшегося пирувата определяют фотометрически по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, в которой образуется 2,4-динитрофе-нилгидразон, имеющий красно-бурую окраску в щелочной среде. Интенсивность последнего прямо пропорциональна содержанию кетокислоты.

ЛДГ

СН₃-СН(ОН)-СООН + НАД⁺ → СН₃-СО-СООН + НАДН(Н⁺)

лактат пируват

Ход работы. В одну пробирку вносят 0,1 мл в 3 раза разбавленной сыворотки крови, 0,3 мл свежеприготовленного раствора 0,02 моль/л НАД⁺ и ставят на 5 мин на водяную баню при 37°С для нагревания смеси. В другую пробирку вносят 0,8 мл раствора 0,03 моль/л натрия пирофосфата, 0,2 мл раствора 0,45 моль/л натрия лактата и нагревают на водяной бане при 37°С. Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 0,2% раствора 2,4-динитрофенилгидразина в растворе 1 моль/л хлоридной кислоты и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре для образования гидразона. К смеси прибавляют 5 мл раствора 0,4 моль/л натрия гидроксида, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЕК при длине волны 520-560 нм в 10 мм кюветах. Контрольную пробу готовят также как и опытную, но разбавленную сыворотку прибавляют после инкубации. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

№ про-бир- ки	Рабочий стандартный раствор натрия пирувата, мл	Раствор 0,03 моль/л натрия пирофос-фата, мл	Дист. вода, мл	Концент-рация пирувата в пробе, мкмоль	Единицы актив-ности ЛДГ ммоль/ л∙ч	Экс-тинк-ция
1	0,1	0,8	0,5	0,01	1,2
2	0,2	0,8	0,4	0,02	2,4
3	0,4	0,8	0,2	0,04	4,8
4	0,6	0,8	-	0,06	7,2
5	0,8	0,8	-	0,08	9,6

На оси ординат откладывают значение экстинкции, а на оси абсцисс - соответствующие им единицы активности ЛДГ, которые выражены в ммоль/(л∙ч).

Клинико-диагностическое значение. Определение активности ЛДГ используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики заболеваний, а также как тест на выздоровление. В норме активность фермента в сыворотке крови составляет 0,8-4,0 ммоль/(л∙ч). Она повышается при повреждении миокарда, лейкозе, болезни почек, гемолитической и серповидноклеточной анемии, тромбоцитопении, инфекционном мононуклеозе, а также при прогрессирующей мышечной дистрофии. При болезнях, которые сопровождаются некрозом тканей (инфаркт миокарда, некротические поражения почек, гепатит, панкреатит, опухоли) наблюдают резкое повышение активности ЛДГ в сыворотке крови. При остром гепатите она повышается в первую неделю желтушного периода, при легкой и средней степени тяжести болезни - быстро нормализуется. У больных с острым инфарктом миокарда наблюдается повышение активности общей ЛДГ и ЛДГ₁ в сыворотке крови через 8-18 часов после начала приступа, которое достигает максимума через 24-72 часа. Активность ферментов остаётся высокой на протяжении первой недели и нормализуется на 6-10 день. Также имеет значение определение соотношения ЛДГ₁/ЛДГ₂, которое в норме составляет 0,4-0,74, а при остром инфаркте миокарда возрастает в 5-10 раз. При стенокардии активность ЛДГ в сыворотке крови не повышается.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 106-114.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 140-147.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 86-93, 98-102.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 137-160.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 145-157, 163-168.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 102-123.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 84-92.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 43-50.

9. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

10. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 89-104.