4. Цель и принципы окрашивания гистологического препарата.

Клетки и ткани животного происхождения обладают избирательной способностью к красителям. Поэтому окрашивание срезов необходимо производить для того, чтобы в преломляющем свете микроскопа можно было отчетливо рассмотреть различные тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах можно рассмотреть только такие части, которые отличаются друг от друга различными преломлением световых лучей. Выявление невидимых на срезе деталей строения основано на неодинаковом (избирательном) их отношении к различным красителям.

5. Свойства красителей, принципы окрашивания.

Красители классифицируются по происхождению и химическому составам. По свойствам они делятся на группы кислых и основных красителей. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями т.е. обладают оксифильными (ацидофильными) свойствами. К группе кислых красителей относятся: кислый фуксин, пикрофуксин, пикриновая кислота, эозин. Чаще всего мы будем изучать срезы, обработанные эозином, который окрашивает цитоплазму, оболочку клеток, межклеточное вещество соединительной ткани в розовый цвет. По происхождению - эозин искусственный краситель.

К группе основных (базофильных) красителей, с которыми реагируют базофильные компоненты клеток и межклеточного вещества кислой природы (РНК, ДНК, гиалуроновая к-та и др.). относятся: кармин, сафранин, метиловый синий, азур, гематоксилин ( по способу приготовления краски различают гематоксилин Майера, Бемера. Вейгерта, железный гематокси­лин Гейденгайна и др.). Красящим свойством обладают не сам гематоксилин, а продукт его окисления. Гематоксилин окрашивает базофильные структуры в синий или фиолетовый цвет. Этот краситель растительного происхождения, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и у нас в Армении. Гематоксилин выявляет четко ядра клеток. Изучаемые нами препараты чаше всего будут окрашены гематоксилин-эозином. Кармин, также ядерный краситель, но животного происхождения, вырабатывается из насекомых кошенели, живущих на кактусовых деревьях. Большинство же красителей получены синтетическим путем (искусственные краски). Имеются красители со специальными свойствами, позволяющие выявить ее компоненты, окрашиваемые черным цветом (импрегнация солями серебра – для окраски нейронов, судан черный, осмиевая кислота выявляют липиды). Гликоген выявляется кармином Беста или шик реакцией по мак-Манусу. В данном случае, мы видим в срезах не сам гликоген, а продукт реакции его с красителем, просматривающийся в виде гранул лилово-красного цвета.

Изготовление гистологического препарата.

Процесс обработки материала для изготовления гистологических препаратов слагается из следующих этапов:

1. Взятие материала. Из органа вырезается кусочек, размеры которого не должны превышать 1 куб. см.

2. Фиксация материала. Фиксация проводится для того, чтобы остановить в тканях протекающие жизненные процессы и предупредить последующий их распад. Фиксирующие жидкости: 10-12% раствор формалина в воде (фиксировать от 3 часов до 1 суток и более).

3. Обезвоживание материала, обезжиривание и уплотнение его. Этот процесс осуществляется в спиртах возрастающей крепости и в растворах спирта с эфиром в следующей последовательности: зафиксированный кусоочек материала проводят через батарею спиртов: 5-. 70, 96 градусов (две порции), абсолютный спирт, абс. спирт + эфир) (две порции). В каждом отмеченном растворе кусочек находится не менее суток.

4. Заливка материала. Заливка производится в парафин, целлоидин или желатину. Наиболее распространенный способ заливки в целоидин. Для этого готовится раствор целлоидина разной консистенции (измельченная кинолента растворяется в смеси 100 спирта с эфиром в соотношении 1:1). Обезвоженный, уплотненный кусочек материала проводится в 3-х порциях целлоидина возрастающей крепости. В каждой порции раствора целлоидином кусочек материала переносят в плоскодонную чашку, которую до краев заполняют густым раствором целлоидина. В чашке кусочек органа, пропитанный целлодином, подсыхает до плотности рога и оказывается залитым в целлоидин. Залитый материал может долго храниться.

5. Приготовление гистологических срезов. Залитый в целлоидин кусочек материала наклеивают на блок (деревянный или стеклянный кубик), укрепляют на предметном столике микротома (микротом-прибор оснащенный бритвой для приготовления гистологических срезов) и бритвой производятся срезы, толщина которых не должна превышать 10-12 микрон. Каждый студент должен самостоятельно сделать 3-4 среза.

6. Окраска гистологических срезов. Различные тканевые элементы избирательно относятся к красителям, что, позволяет их дифференцирование окрасить. Ядра клеток прочнее окрашиваются основными красителями (гематоксилин, азур, кармин и др.). Цитоплазма красителя кислыми красителями (эозин, фуксин, аналин и др.).

7. Обезвоживание, просветление окрашенных срезов и заливка их в бальзам. Окрашенные срезы обезвоживают в 2-х порциях 96 спирта, просветляют в карболе-ксиоле. переносят посредством шпателя на предметное стекло, наносят на срез каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.

Препарат готов для исследования может храниться долгое время.

Каждый студент должен самостоятельно в течение семестра освоить технику изготовления гистопрепаратов и приготовить к итоговому зачету по общей гистологии гистосрезы того или иного органа. Работа будет проводиться под руководством сотрудника в научной лаборатории кафедры морфологии.