Стафилококки гемолитические

Возбудитель туберкулеза

Стрептококки гемолитические

Другие микроорганизмы

Благоприятные условия – плохая проветриваемость

Относительно много микроорганизмов

Закрытые помещения

Неблагоприятные условия – мало питательных веществ

Источник – дыхательные пути и желудочно-кишечный тракт человека и животных

ВОЗДУХ

Открытые помещения

Относительно мало микроорганизмов

Действие солнечных лучей, высушивание

Возбудитель дифтерии

Возбудитель туберкулеза

Сарцины

Грибы

Актиномицеты

Другие микроорганизмы

О микробном загрязнении воздуха судят по микробному числу воздуха. Микробным числом называется количество мик­робов содержащихся в 1 м³ воздуха.

Кроме того, определяют количество санитарно-показательных микробов. Санитарно-показательными микробами воздуха являются пато­генные стафилококки, гемолитические и зеленящие стрептококки, которые обитают в верхних дыхательных путях человека и загрязняют воздух.

Для микробиологического исследования воздуха используют мето­ды, основанные на осаждении (седиментации) и аспирации. При помощи седиментационных методов можно получить общее представление о содержащихся в воздухе микробах. Аспирационные методы дают возможность определить не только качественное, но и количественное содержание микробов в определенном объеме воздуха.

Метод седиментации (метод Коха) - простейший метод бактериологического исследования, основан на оседании бактериальных частиц под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (с частицами пыли и капельками аэрозоля) на поверхность агара открытой чашки Петри. Метод оседания не дает представления о количественном содержании микрофлоры в воздухе, так как плохо улавливаются тонкодисперсные фракции частиц, а задерживаются крупные пылевые частицы. Нередко колонии образуются не из единичной клетки, а из скопления микробов, и на применяемых питательных средах вырастает только часть воздушной микрофлоры. Этот метод используется только для оценки воздуха помещений и не применяется для атмосферного воздуха, где имеют место колебания в скорости его движения.

Нормативы микробной загрязненности воздуха рассчитаны на аспирационный метод и исследуются только с помощью специальной аппаратуры.

Аспирационные методы основаны на отборе проб воздуха с помощью приборов. В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1), бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1), прибор Киктенко, приборы Андерсена, Дьяконова, МБ и др. Для исследования атмосферы могут быть использованы и мембранные фильтры № 4, через которые воздух просасывается с помощью аппарата Зейтца. Большое разнообразие приборов свидетельствует об отсутствии универсального аппарата и о большей или меньшей степени их несовершенства.

Прибор Кротова. В настоящее время этот прибор широко применяется при исследовании воздуха закрытых помещений и имеется в лабораториях СЭС.

Рис. . Аппарат Кротова для бактериологического исследования воздуха.

Принцип работы аппарата Кротова основан на том, что воздух, просасываемый через клиновидную щель в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе. Чашку Петри с тонким слоем среды укрепляют на вращающемся столике аппарата, что обеспечивает равномерное распределение бактерий на ее поверхности. Работает аппарат от электросети. После отбора пробы с определенной экспозицией чашку вынимают, закрывают крышкой и помещают на 48 ч в термостат. Обычно отбор проб проводят со скоростью 20-25 л/мин в течение 5 мин.

Рис. . Пробоотборник бактериологический «Тайфун» Р-40 (М) (типа аппарата Кротова).

Таким образом, определяется флора в 100-125 л воздуха. При обнаружении санитарно-показательных микроорганизмов объем исследуемого воздуха увеличивают до 250 л.

Приемник перед забором пробы воздуха заполняется 3—5 мл улавливающей жидкости (водой, мясопептонным бульоном, изотоническим раствором хлорида натрия).

Рис. . Система отбора и анализа проб воздуха на микробную обсемененность (Himedia).

Прибор Речменского работает по принципу пульверизатора: при прохождении воздуха через узкое отверстие воронки жидкость из приемника через капилляр в виде капелек поднимается в цилиндр. Капли жидкости еще больше дробятся, ударяясь о стеклянную лопаточку и стенки сосуда, создавая облачко из мелких капелек, на которых и адсорбируются находящиеся в воздухе микроорганизмы. Насыщенные бактериями капли жидкости стекают в приемник, а затем опять диспергируются, что обеспечивает максимальное улавливание бактерий из воздуха. При работе прибор помещают под углом 15—25°, что обеспечивает стекание улавливающей жидкости в приемник. Скорость отбора проб воздуха через аппарат Речменского - 10-20 л/мин. По окончании работы жидкость из приемника забирают стерильной пипеткой и засевают (по 0,2 мл) на поверхность плотных питательных сред. Преимуществом бактериоуловителя Речменского является высокая эффективность улавливания бактериальных аэрозолей. Недостатки прибора заключаются в трудности его изготовления, нестандартности получаемых аппаратов, их большой хрупкости и сравнительно низкой производительности.

Большим преимуществом являются серийный выпуск этого прибора (что дало возможность оснастить им лаборатории СЭС), его портативность, более высокая производительность (20—25 л/мин). Колба прибора, в которую помещается улавливающая жидкость, изготовляется из термостойкого плексигласа, капилляр из нержавеющей стали. В колбу вмонтирован пульверизатор, вызывающий диспергирование улавливающей жидкости при просасывании воздуха. Такое устройство дает возможность легко очищать и стерилизовать колбу с диспергирующим устройством простым кипячением в течение 30 мин (автоклавирование недопустимо, так как оно вызывает деформацию цилиндра).

Перед забором проб воздуха в колбу вносят 5-10 мл улавливающей жидкости (чаще всего мясопептонный бульон) и устанавливают ее под углом 10°, что обеспечивает естественное стекание жидкости после диспергирования. Воздух, проходя через колбу и пульверизатор, вызывает образование мелких капелек улавливающей жидкости, на которых оседают микроорганизмы. Прибор ПОВ-1 применяется для исследования воздуха закрытых помещений на общую микробную обсемененность, для обнаружения патогенных бактерий (например, микобактерий туберкулеза) и респираторных вирусов в воздухе больничных палат.

Пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1). Механизм действия ПАБ-1 основан на принципе электростатического осаждения частиц аэрозоля (следовательно, и микроорганизмов) из воздуха при прохождении его через прибор, в котором эти частицы получают электрический заряд и осаждаются на электродах с противоположным знаком. На электродах для улавливания аэрозолей помещают в горизонтальном положении металлические поддоны с твердыми средами в чашках Петри или жидкой питательной средой (15—20 мл). Прибор переносной с большой производительностью 150-250 л/мин, т.е. за 1 ч можно отобрать 5—6 м3 воздуха. Его рекомендуют применять для исследования больших объемов воздуха при обнаружении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, например, при выявлении в воздухе палат больниц возбудителей внутрибольничных инфекций (Pseudomonas aeruginosa. Staph, aureus и др.), определении сальмонелл и эшерихий в атмосферном воздухе в местах дождевания при орошении земледельческих полей сточными водами.

Бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1). Прибор основан на аспирационно-ионизационном принципе действия. БВЭП-1 состоит из осадительной камеры, в которую вмонтированы электроды: отрицательный в виде приводящей трубки, через которую поступает воздух (и частички аэрозоля соответственно заряжаются отрицательно), и положительный, на котором оседают бактерии.

Прибор МБ. Этот прибор служит не только для определения общей микробной обсемененности, но и для отбора проб воздуха с аэрозольными частицами различных размеров. Прибор МБ построен по принципу «сита» и представляет собой цилиндр, разделенный на 6 горизонтальных полос, на каждую из которых помещают чашки Петри с МПА. Воздух просасывается, начиная с верхней ступени, в пластине которой отверстия самые крупные, и чем ниже ступень, тем меньше размером отверстия (через последние проходят только тонкодисперсные фракции воздушного аэрозоля). Прибор рассчитан на улавливание частиц аэрозоля размером более 1 мкм при скорости отбора воздуха 30 л/мин. Уменьшение числа отверстий обеспечивает более равномерное распределение по питательной среде аэрозоля из воздуха. Для улавливания еще более мелких частиц аэрозоля можно добавлять дополнительно фильтр из фильтрующего материала АФА.

При использовании любого из перечисленных приборов получаемые результаты являются приблизительными, однако они дают более правильную оценку обсемененности воздуха в сравнении с седиментационным методом. Поскольку и отбор и санитарно-микробиологические исследования воздуха не регламентированы ГОСТ, то можно использовать любой прибор для оценки бактериальной загрязненности воздуха. Во многих случаях отбор проб совмещен с этапом посева.

После инкубации посева производят расчет микробного числа по формуле:

количество колоний, выросших на чашке

Микробное число воздуха = х 1000*

объем пропущенного воздуха (л)

* - искомый объем воздуха

Официальных стандартов чистоты воздуха жилых помещений не разработано, у нас в стране приняты примерные показатели для оценки чистоты воздуха жилых помещений.

Таблица . Критерии для оценки воздуха жилых помещений

(число микроорганизмов в 1м³ по А.И.Шафиру).

Оценка воздуха	летнее время		зимнее время
	всего микробов	стафилококки, гемолитический и зеленящий стрептококки	всего микробов	стафилококки, гемолитический и зеленящий стрептококки
чистый	менее 1500	менее 16	менее 4500	менее 36
загрязненный	более 2500	более 36	более 7000	более 124

В настоящее время все большее внимание уделяется непосредственному обнаружению патогенных и условно патогенных микроорганизмов. При исследовании воздуха стационаров (хирургические клиники, родильные дома) основное внимание направлено на определение патогенных стафилококков, а так же грамотрицательных условно патогенных бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций.

Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды проводят в помещениях лечебных организаций в зависимости от их функционального назначения на санитарно-микробиологические показатели:

- общее количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха (КОЕ/м³)

- количество колоний S. aureus в 1 м³ воздуха (КОЕ/м³)

- количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 м³ воздуха

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применению в установленном порядке.

Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 дм³ для определения общего количества микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов и 250 дм³ для определения S.aureus. Исследование воздуха седиментационным методом не допускается.

Для определения общего количества микроорганизмов в 1 м³ воздуха забор проб проводят на питательный агар типа МПА, СПА, ГРМ-агар и другие, приготовленные согласно инструкций по применению. Посевы инкубируют при температуре 37⁰С в течение 48±2 ч, подсчитывают количество выросших колоний и производят перерасчет на 1 м³ воздуха. При наличии роста колоний дрожжевых и плесневых грибов, их подсчитывают и делают пересчет на 1 м³ воздуха. В протоколе количество дрожжевых и плесневых грибов указывают отдельно.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха на стафилококк.

Первый день. Для определения наличия S. aureus забор проб проводят на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококкагар, маннитолагар или среда №10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37⁰С 48±2 ч.

Второй - третий день. На выше указанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. Следует учитывать, что стафилококки, выделенные от человека, дают положительную лецитовителлазную реакцию в 60-70% случаев. Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2-х колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию (образование радужного венчика). При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при 37⁰С на 24±2 часа.

Четвертый день. После инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности в реакции плазмокоагуляции (РПК).

Окраску по Граму проводят общепринятым методом. Под микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками («кружево»).

Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется учитывать другие признаки, позволяющие определить принадлежность штамма к виду S. aureus (ферментация маннита, гемолитическая активность).

При необходимости, после выделения чистой культуры, проводят определение чувствительности/устойчивости к антибиотикам, дезинфектантам, бактериофагам.

Пятый день. Учет результатов дополнительных тестов. Окончательная выдача ответа.

Таблица . Допустимые уровни микробной обсемененности воздуха помещений некоторых отделений стационара.

Место отбора проб	Время отбора проб	Результаты исследований
		Общее количество микробов (КОЕ/м3)	содержание
			золотистый стафилококк	грамотрица-тельные м/о
Операционный блок	до работы	не более 500	отсутствие	отсутствие
	после работы	до 1000	отсутствие	отсутствие
Реанимационное отделение (палаты)	подготовленные к работе	не более 1000	отсутствие	отсутствие
Процедурная	до работы	не более 50	отсутствие	отсутствие
	во время работы	1000	не более 1-2	не более 1-2

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха аптеки

Исследование проводят аспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применению в установленном порядке. Скорость просачивания воздуха должна быть не менее 25 л/мин. Количество пропущенного воздуха 100 дм³ для определения общего числа бактерий и 250 дм³ для выявления Staphylococcus aureus, дрожжевых и плесневых грибов.

Для получения роста сапрофитных бактерий используют МПА, грибов - сусло-агар или среду Сабуро, золотистого стафилококка - желточно-солевой агар. Исследование проводят, выше, указанным способом. После инкубации посевов в термостате подсчитывают количество выросших колоний и проводят пересчет на 1 м³ воздуха.

Таблица . Допустимые нормы микробного числа воздуха различных помещений аптеки

Наименование помещений	Условия работы	Количество микробов в 1 м3 воздуха
		Общее	St.aureus	Плесневые и дрожжевые грибы
Асептический блок, стерилизационная	До работы	не выше 500	не должно быть в 250 л воздуха	не должно быть в 250 л воздуха
	После работы	не выше 1000	то же	то же
Ассистентская, расфасовочная	До работы	не выше 750	не должно быть в 250 л воздуха	не должно быть в 250 л воздуха
	После работы	не выше 1000	то же	то же
Моечная	Во время работы	не выше 1000	не должно быть в 250 л воздуха	до 12
Зал обслуживания	Во время работы	не выше 1500	до 100	до 20

Забор воды для бактериологического исследования.

Забор воды для бактериологического анализа производят в стерильные бутыли из стекла или одноразовую посуду емкостью не менее 500 мл с резиновыми или силиконовыми (но не ватно-марлевыми), плотно закрывающимися, пробками и защитными колпачками из алюминиевой фольги или плотной бумаги. Водопроводный кран, без резиновых шлангов и предварительного обжига, открывают, спускают воду и без изменения напора собирают не менее 500 мл воды. Емкости с пробами должны быть заполнены так, чтобы между водой и пробкой оставалось пространство (для предотвращения смачивания пробки при транспортировке). Пробы в емкостях закрывают проб­ками и стерильными колпачками, маркируют, прикрепляя этикетки или нанося надпись несмываемой краской, составляют акт о взятии проб воды, с указанием места и времени, даты отбора проб, харак­теристики водоисточника (температура воды, климатические условия окружающей среды), фамилию лица, взявшего пробу. Пробы питьевой воды должны быть помещены в контейнер-холодильник при температуре 4-10°С. Бактериологическое исследование должно производиться не позднее 6 часов с момента отбора проб, если пробы нельзя охладить, то прове­дение исследования должно состояться не позднее, чем через 2 часа после забора.

Для взятия проб воды из глубины (открытых водоемов, колодцев, бассейнов и т. д.) используют специальные приборы: батометр, приборы Исаченко, Рутнера и др. Батометр представляет собой металлический каркас длиной 0,5-1 м (рис. ). Каркас изготавливается из металла, не подвергающегося коррозии, и может компактно складываться, так как состоит из отдельных колец. Дно каркаса свинцовое и служит грузилом. Внутрь устанавливают стерильную бутыль, закрытую стерильной резиновой или корковой пробкой с кольцом, к которому привязана веревка. При погружении в воду на необходимую глубину, потягивая за веревку, пробку открывают, сосуд заполняется водой, о чем свидетельствует прекращение появления пузырьков воздуха на поверхности воды. Веревку опускают, бутыль автоматически закрывается. После извлечения батометра притертую пробку заменяют стерильной ватной (которая должна быть завернута в бумагу и находиться в комплекте с батометром). Для взятия проб с большой глубины (более 30 м) можно использовать приборы Исаченко, Рутнера, Романенко-Младова. При отсутствии батометров пробу воды можно отбирать с помощью бутыли, в пробку которой монтируют две стеклянные трубки, соединенные резиновым шлангом. Одна трубка длинная и доходит до дна бутыли, другая - короткая. К резиновому шлангу привязывают веревку. Бутыль на тросе опускают в водоем и на заданной глубине, дернув за веревку, снимают резиновую перемычку со стеклянных трубок, вода начинает поступать в длинную трубку, а через короткую выходит воздух. После отбора пробы, бутыль достают из водоема, тут же закрывают ватными пробками отверстия стеклянных трубок и отправляют на исследование. Родниковую воду берут непосредственно из струи или из середины текущего родника, на расстоянии 10-15 см от поверхности и дна. Артезианскую и колодезную воду забирают на глубине 10-15 см от поверхности воды. Из проруби пробы отбирают на глубине 10-15 см от нижнего края 40 льда. Из открытых водоемов, как правило, берут серию проб на разном удалении от берега на различной глубине с учетом места водозабора и движения воды. Лед, используемый на пищевых предприятиях и в хранилищах, также подвергается санитарно-микробиологическому исследованию. Для анализа берут кусок льда не менее 2 кг, в лаборатории его обмывают стерильной водой и стерильными инструментами из глубины вырубают несколько кусочков так, чтобы общая масса была около 500 г. Лед помещают в стерильную посуду и оставляют при комнатной температуре, после растаивания исследуют как воду. Пробы сточных вод также забирают в стерильные бутыли. Однако объем каждой пробы может колебаться от 500 до 10 мл в зависимости от места взятия (при проверке отдельных этапов очистки, после обработки, перед сбросом в водоем) и от задач анализа.

Рис. . Батометр.

Рис. . Батометр Молчанова. Рис. .Автоматический портативный батометр

Загрязненность воды определяется по общей микробной обсемененности и обнаружению санитарно-показательных микроорганизмов – индикаторов наличия выделений человека и животных. Для изучения общей обсемененности исследуемой воды определяют общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (МАФАМ), способных в результате инкубации при 37°С в течение 24 часов образовывать, видимые невооруженным глазом или при увеличении в два раза, колонии на питательной среде. Исследуют общее число МАФАМ в 1 мл воды.

Определение общего числа микроорганизмов в воде, образующих колонии на питательной среде.

Метод определяет в воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном aгape при температуре 37°С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.

При исследовании водопроводной воды берут не менее 2-х объемов по 1 мл;

вода водоемов: чистая – 1,0; 0,1 мл;

загрязненная – 0,01; 0,001 мл.

Для посева объемов 0,1 мл и меньше, исследуемую воду разводят стерильной дистиллированной водой, готовя 10-кратные разведения. По 1 мл каждого разведения засевают на пита­тельную среду.

1 день. На дно стерильных чашек Петри наливают по 1 мл исследуемой воды (из каждой пробы не менее двух объемов), в эти же чашки выливают 8-12 мл МПА, расплавленного и остуженного до 45-49°С, интенсивно перемешивают питательную среду с во­дой, оставляют чашки на горизонтальной поверхности до застывания агара, после чего помещают в термостат на 24 часа при 37°С.

2 день. Подсчитывают все выросшие колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают чашки на которых выросло не более 300 изолированных колоний и производят расчет. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.

Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ/ мл – ориентировочно».

Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост». Общее количество МАФАМ воды в 1 мл не должно превышать 100.

Вода наряду с почвой представляет естественную среду обитания микроорганизмов. Разнообразные микроорганизмы широко распространены как в воде открытых водоемов, океанов, морей, так и в грунтовых водах. Совокупность микроорганизмов, населяющих толщу воды и находящихся в ней во взвешенном состоянии, обозначают термином – «микробный планктон». Вода открытых водоемов является средой обитания различных микроорганизмов – палочки, кокки, вибрионы, спириллы, спирохеты, различные фотосинтезирующие бактерии, флюоресцирующие, пигментные, спорообразующие бактерии, грибы, простейшие, вирусы – вот далеко не полный перечень микробов, формирующих водный «микробный планктон». Численный состав микроорганизмов г лавным образом зависит от содержания органических веществ, а так же физико-химического состояния воды (рН, температура, содержание солей и т.д.), глубины водоема, климатических условий, приближенности к населенным пунктам, выпуска сточных вод без очистки и т.п. Микрофлора воды представлена аутохтонной – совокупность микроорганизмов, постоянно живущих и размножающихся в воде (микрококки, различные виды протея и лептоспиры, бациллы, псевдомонады, клостридии и т.д.) и аллохтонной – совокупность микроорганизмов, случайно попавших в

ГИДРОСФЕРА. РАСПРОСТРАНЕНИЕ БАКТЕРИЙ В ВОДЕ

Схема

Факторы, способствующие выживанию

Спорообразование

В.anthracis