І.4. Способи культивування вірусу Ньюкаслівської хвороби і.4.1. Зараження ембріонів
Для виділення вірусів грипу у курячих ембріонах досліджувані матеріали після їх первинної обробки вводять до амніотічної і аллантоїсної порожнини 9 - 11-денних курячих ембріонів.
Зараження проводять у затемненому боксі через бокову поверхню шкаралупи, направляючи голку спочатку в амніотичну, а потім у аллантоїсну порожнини, попередньо зробивши два проколи у шкаралупі (над повітряною камерою і в районі вічка ембріона) (рис. 2).
Заражені ембріони інкубують у термостаті 48 год при температурі 36 – 37 0С. Амніотичну і аллантоїсну рідину збирають в окремі пробірки з подальшим їх титруванням у реакції гемаглютінаціі (РГА).
Рис. 2. Зараження вірусом Ньюкаслівської хвороби у курячих ембріонів (за Свинцовим РІК?) []
Індикацію вірусів грипу здійснюють у РГА мікрометодом. Результати РГА враховують після 30 - 40 хвилинного осідання еритроцитів у лунках панелей при кімнатній температурі.
При відсутності аглютинації еритроцитів проводять 2 додаткових пасажі шляхом зараження ембріонів сумішшю амніотичної і аллантоїсної рідин від попереднього пасажу. У разі негативних результатів РГА після 2 пасажів матеріалів дослідження припиняють[19, 20, 21, 22].
Вихідний матеріал для зараження ембріонів - суспензія головного мозку і селезінки загиблих від азіатської чуми курей у фізіологічному розчині.
Матеріал після перевірки на відсутність в ньому бактеріального забруднення (посіви на поживні середовища) ретельно розтирають у ступці зі стерильним піском або скляним порошком і розводять у фізіологічному розчині. Суспензію зливають у пробірку і через кілька хвилин її верхній шар розводять до потрібної пропорції фізіологічним розчином. Отриманим розведенням заражають ембріони у встановленій дозі. Так само можна використовувати для пасажів вірусів головки 2 - 3 ембріонів, що загинули протягом одного - двох днів після зараження їх вірусом. Головки повинні бути бактеріологічно стерильними. Суспензію готують так само як і з трупного матеріалу [15, 17, 187, 21, 23].
При виявленні бактеріального забруднення матеріал для зараження фільтрують через азбестові платівки Зейтца або фільтрувальні свічки.
Для зараження беруть 7 - 8 денного віку ембріони, отримані з інкубаторних птахівничих станцій. Можна так само інкубувати ембріони до необхідного віку власне у лабораторії, поклавши їх до спеціального інкубатору або ж у термостат, при дотриманні необхідних умов. Перед зараженням, яйця переглядають в темній кімнаті через овоскоп для визначення життєздатності (рухливості) зародків та місця їх розташування у яйці. Малорухомі, нерухомі, а так само слабкі і недорозвинені ембріони вибраковують.
Яйця придатні для зараження переносять у стерильний бокс. Далі їх стерилізують спиртом і фламбують палаючою ватою змоченою у спирті.
Зі стерильним яйцем проводять необхідні для зараження маніпуляції (проколювання шкаралупи, зміщення внутрішнього вмісту, ін'єкцію вірусу). Обов'язковим моментом є точне маркування кожного окремого яйця і розведення вірусу і повторності зараження.
Потім яйця складають до термостату або інкубатору з необхідними умовами і через 18 - 20 годин після зараження проводять перший перегляд. Всі яйця із загиблими ембріонами видаляють з термостату як технічний брак.
Після зараження ембріони гинуть не раніше ніж через 22 - 23 години, а слабкі штами (непасажовані) викликають їх загибель з затримкою до 60 годин і, як виняток, до 3 - 5 діб.
Після закінчення 22 - 24 діб після зараження проводять повторний перегляд; яйця з загиблими ембріона витягають із термостату і піддають подальшому дослідженню (подальші перегляди яєць необхідно проводити через кожні 2 - 3 години, як виняток 4 - 5 годин, коли штам вірусу менш вірулентний). Припустимо так само вилучення разом з мертвими ембріонами і ембріонів, що у процесі загибелі (малорухливі ембріони), тому що в них вже розвивається вірус [2, 3, 14, 15, 16, 22].