1.6. Gdnf и его функциональная роль
Фактор роста нервов, выделенный в 1952 году, 63 года назад, стал прототипом для классификации всех НТФ. При связывании со специфическими рецепторами определенных нейронов в периферической и центральной нервной системе, фактор роста нервов действует, повышая выживаемость нейронов. В последующие годы после открытия были обнаружены многие другие нейротрофические факторы - некоторые структурно связаны с фактором роста нервов, а другие отличны от него. Один из таких НТФ – это глиальный нейротрофический фактор GDNF.
В 1993 году впервые был очищен и клонирован GDNF,мощный нейротрофический фактор, который повышает выживание допаминергических нейронов среднего мозга. Его выделили из допаминергических нейронов глиальных клеток среднего мозга крысы, поскольку в эмбриональных культурах среднего мозга, рекомбинантный человеческий GDNF способствовал выживанию и морфологической дифференциации нейронов и увеличивал их родство к поглощению дофамина (Lin et al., 1993). Открытие GDNF положило начало семейству (группе) глиального нейротрофического фактора (Glial Cell Derived Neurotrophic Factor, GDNF). В это семейство входят родоначальник, собственно GDNF и недавно открытые нейротрофические факторы: нейртурин (Neurturin, NTR)(Kotzbauer et al., 1996), артемин (Artemin, ART)(Baloh et al., 1998), персефин (Persephin, PSP)(Milbrandt et al., 1998). Нейртурин был выделен благодаря его способности поддерживать выживание допаминергических нейронов эмбриональных культур среднего мозга. Персефин обнаружили в результате его гомологии с GDNF и NTN (Milbrandt et al., 1998).
Благодаря наличию у семейства GDNF семи консервативных остатков цистеина с одинаковым интервалом его члены являются отдаленными родственниками подсемейства трансформирующего ростового фактора (transforming growth factor-β, TGF-beta). Однако если для TGF-beta реализация сигнала осуществляется через серин-треонин киназный рецептор, то GDNF и другие представители его подсемейства включают каскад реакций через тирозин-киназные Ret рецепторы (REarranged during Transfection, Ret) (Гомазков, 2011).
Молекула GDNF человека – гликозилированный полипептид, который существует в своей нативной форме в виде гомодимера и состоит из 135 аминокислотных остатков, имеет молекулярную массу 34,5 кДа (рис. 15).
Рис. 15. Модель пространственной структуры GDNF (по: RCSB PDB http://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=1AGQ&bionumber=1).
Ген GDNF был картирован в 5 хромосоме человека в p12-р13.1 (Schindelhauer, 1995), и дает две формы альтернативно-сплайсинга для белоков-предшественников с 211 и 185 аминокислотных остатков, соответственно (рис. 16).
Рис. 16. Аминокислотная последовательность GDNF (по: RCSB PDB http://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=1AGQ&bionumber=1).
Члены семейства GDNF являются лигандами рецептора RET (Airaksinen et al., 1999) и используют рецепторы, которые обладают активностью тирозин-киназы. Участки действия GDNF лигандов (GDNF family ligand, GFL) широки и включают нейроны ЦНС и периферической нервной системы. В ЦНС участки действия GFL включают дофаминергические нейроны мозга (Klein et al., 1997), спинной и лицевой моторные нейроны (Milbrandt et al., 1998), клетки Пуркинье (Mount et al., 1995), и норадренергические нейроны (Arenas et al., 1998). Соответственно, лиганды подсемейства GDNF служат факторами поддержания жизненности допаминовых нейронов среднего мозга, мотонейронов, норадренергических нейронов, а также симпатических, парасимпатических и сенсорных нейронов.
Многокомпонентная система GFL рецепторов характеризуется перекрытием действия представителей семейства GDNF. Компонентом сигнализации является Ret-рецептор тирозинкиназы, и GDNF может активировать Ret (Creedon et al., 1997). Активация Ret с помощью GDNF требует наличие гликозильного-фосфатидилинозита (glycosyl-phosphatidylinositol, GPI). GFL связываются с трансмембранным рецептором RET через высокоаффинные корецепторы семейства GFRα (GDNF family receptor alpha). Были идентифицированы GFRα1, GFRα2, GFRα3 и GFRα4 и существует специфика связывания: GFRα1 функционирует преимущественно как рецептор GDNF, GFRα2 как рецептор NTR, GFRα3 как рецептор ART, GFRα4 как рецептор PSP (рис. 17) (Mulligan, 2014).
Рис. 17. Взаимодействие лигандов подсемейства GDNF с рецепторной тирозинкиназой RET. a- связывание GFL с рецептором RET, b - образование комплекса GFRα-1 - GDNF (по: Mulligan, 2014).
В норме все эти комплексы GFL - GFRα приобретают способность взаимодействовать с общим сигнальным рецептором RET, запуская его димеризацию на клеточной поверхности и аутофосфорилирование во внутриклеточном домене. Комплекс GFRα-1 - GDNF рекрутирует 2 молекулы RET и инициирует ассоциацию с Src (Src kinases, не связанная с клеточным рецептором тирозинкиназа, участвующая в процессах эмбрионального развития и клеточного роста), которая необходима для эффективной сигнальной трансдукции (Saarma, 2000). Внутриклеточные тирозиновые основания киназной петли RET транс-аутофосфорилируются и происходит активация множества различных сигнальных путей (Song, Moon, 2006).
GDNF способен активировать внутриклеточные каскады через GFRα независимо от RET. При этом происходит инициация Src с последующим фосфорилированием митоген-активируемой протеинкиназой (Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK), PLCγ (phospholipase Cγ, PLCγ), транскрипционным фактором CREB и индукцией c-fos. В отсутствии GDNF RET и GFRα формируют комплекс и индуцируют апоптоз (Saarma, 2000).
Протективное действие GDNF связано с включением антиапоптического и антиаутофагального механизмов. Таким образом, эти два процесса, действующие «в связке», зависят от индукции нейротрофической защиты и активации тирозинкиназных рецепторов (Shang et al., 2010).
Гастроэнтеро-панкреатическая система кишечных нейронов реагирует на GDNF (Baudry et al., 2012). GDNF также может воздействовать на развитие почек (Tee et al., 2013) и сперматогенез (Huleihel et al., 2013). Это раскрывает большие возможности использования GDNF для терапии широкого спектра заболеваний.
Уровень мРНК GDNF быстро возрастает при повреждении нервной системы (Höke et al., 2000). Характерен рецептор-опосредованный механизм доставки GDNF и его последующий ретроградный транспорт в мотонейронах с выраженным эффектом уменьшения их посттравматической гибели (Iannotti et al., 2003). Экспрессия GDNF не только способствует дифференцировке нейрональных стволовых клеток, но и стимулирует образование нервных отростков у уже сформировавшихся клеток. GDNF распространен практически во всех больших регионах ЦНС и рассматривается как аутокринный регулятор нейромышечной активности, еще GDNF стимулирует рост аксона (Iannotti et al., 2003). Поэтому, можно предполагать, что белки GDNF вовлечены в адаптационные перестройки синаптических связей в ЦНС и ПНС и влияют этим на синаптическую пластичность.