причем краситель в концентрированном растворе стабилен. Другие модификации красителя Гимза и сходного с ним красителя Романовского (например, модификации Лейшмана, Райта, МакНила) тоже могут успешно использоваться, но каждый новый краситель следует проверить на материале, который заведомо дает хорошие результаты при С-окрашивании. На том же материале надо подобрать концентрацию и время окрашивания. Разбавленные растворы красителя Гимза нестабильны, и их следует использовать только свежеприготовленными.

Для инкубации стекол при высокой температуре необходимо подобрать удобную посуду. Обычные стеклянные стаканчики, если их поместить в горячую водяную баню, часто лопаются. Этого недостатка лишены стаканчики из боросиликатного стекла, но они, по-видимому, больше не выпускаются. Пластиковые стаканчики для окрашивания, которые выпускаются различными фирмами, недостаточно массивны, чтобы устойчиво стоять на дне водяной бани, но их можно укрепить с помощью металлической пластины с отверстиями, которая накладывается на баню сверху. Отверстия в пластине надо сделать такого размера, чтобы стаканчик входил в него и удерживался за счет своего расширения у верхнего края, которое расположено под резьбой для крышки. Для окраски лучше использовать не полиэтиленовые стаканчики, а полипропиленовые (Azlon), так как последние не размягчаются при высоких температурах, требующихся для дифференциального окрашивания.

4.2. G-окрашивание

G-окраска занимает центральное место в цитогенетике, она является стандартным методом для идентификации хромосом млекопитающих и других высших позвоночных. Поскольку эта методика очень важна и в то же время очень капризна, в настоящем разделе будут описаны три различные процедуры G- окрашивания. Каждая из них имеет свои преимущества и недостатки. Начинающему исследователю следует самому попробовать все три методики и выбрать, какая из них дает на его материале лучшие результаты.

4.2.1. ASG-метод

Этот метод включает инкубацию препарата хромосом в растворе 2 х SSC с последующим окрашиванием по Гимза [21].

1.Проинкубируйте препарат хромосом в растворе 2 х SSC, предварительно нагретом до 60°С в течение 60 мин. Состав 2 х SSC указан в разд. 4.1.

2.Быстро ополосните препарат дистиллированной или деионизованной водой.

3.Окрасьте по Гимза (разд. 4.1) в течение 45 мин.

4.Промойте дистиллированной водой и насухо промокните.

5.Дав стеклам высохнуть на воздухе, заключите их в DPX или аналогичную заливочную среду. Окрашенный таким способом препарат хромосом человека показан на рис. 9.3. Для того чтобы с помощью

данного метода получить удовлетворительные результаты, необходимо использовать хорошие препараты, где окружающая хромосомы цитоплазма удалена настолько, насколько это возможно, и сами хромосомы не слишком сильно конденсированы. Если хорошая дифференциальная окраска не получается, то для улучшения результатов можно воспользоваться несколькими модификациями данного метода. Некоторые исследователи увеличивают время обработки раствором 2 х SSC до 16 часов, но это ведет к появлению разрыва в хромосомах. В некоторых случаях, если сегментация видна неотчетливо из-за слишком интенсивной окраски, можно добиться лучших результатов, уменьшая время окраски или воспользовавшись более разбавленным раствором красителя.

Если препарат заключен в хорошую заливочную среду, то окраска сохраняется стабильной годами. Однако если заливочная среда со временем портится и становится кислой, то может происходить не только выцветание препарата, но также изменение рисунка хромосом, который начинает напоминать таковой при R-окраске.

Поэтому, если вы сомневаетесь в качестве заливочной среды, ее следует выбросить и заменить свежей.

4.2.2. Окрашивание по Гимза после обработки трипсином

Данный метод достаточно сходен с тем, который описан Сибрайтом [22]; такая процедура является наиболее популярной из всех методик дифференциального окрашивания. Суть ее состоит в том, что препарат хромосом несколько секунд переваривается трипсином, а затем окрашивается по Гимза.

1.Обработайте трипсином препарат хромосом в течение 15 секунд. Концентрированный раствор трипсина можно приготовить, разведя флакон трипсина Bacto (Difco, каталожный № 0153—59) в 10 мл ФСБ; последний можно приготовить из таблеток, выпускаемых фирмой Oxoid. Рабочий раствор готовится путем дальнейшего разведения.

2.Промойте стекла в дистиллированной воде или растворе ФСБ.

3.Окрасьте по Гимза (разд. 4.1).

4.Промойте, промокните насухо и заключите, как описано в разд. 4.1.

196

Рис. 9.3. Метафазная пластинка лимфоцита человека (вверху) и кариотип (внизу) G-окраска в модификации ASG. Воспроизводится с разрешения по Nature New Biology, 232, p.p. 31—32. Copyright 1971, Macmillan Magazines Ltd.

Критический момент в данной методике — это время обработки трипсином, и точные условия можно подобрать только опытным путем. Результаты зависят от качества трипсина, его разведения, времени обработки и чувствительности хромосом. Для начального эксперимента концентрированный раствор трипсина можно разбавить в 10 раз раствором ФСБ, но весьма вероятно, что потребуется дальнейшее его разведение. В принципе, можно пользоваться трипсином любой фирмы, но время и разведение следует подбирать экспериментальным путем., Вместо того чтобы погружать все стекло в трипсин, налитый в стаканчик для окраски, лучше нанести на поверхность стекла несколько капель раствора трипсина. Трипсин в растворе постепенно теряет свои свойства, так что следует пользоваться достаточно свежим раствором.

Хотя для окрашивания рекомендуется краситель Гимза, но в оригинальной прописи использовался краситель Лейшмана [22]; можно попробовать воспользоваться им, если окрашивание по Гимза не дает удовлетворительных результатов.

Получаемый с помощью данного метода рисунок сегментации совпадает с тем, который получается при использовании ASG-метода (рис. 9.3), хотя общая морфология хромосом может быть видна по-разному. Обработанные трипсином хромосомы часто имеют вид рваных, что отчасти может быть следствием избыточной обработки трипсином. Другой особенностью, характерной для окрашивания по Гимза с обработкой трипсином, является наличие темного ободка вокруг хромосом. Это явление может быть полезным, однако ободок не следует путать с концевыми G-сегментами хромосом. После дифференциального окрашивания с помощью ASG-метода темного ободка вокруг хромосом нет, а поскольку концевые G-сегменты при этой окраске обычно выглядят светлыми, то концы хромосом бывает трудно идентифицировать.

4.2.3. Метод Галлимора и Ричардсона

Данный метод является комбинацией ASG-метода и окрашивания по Гимза с обработкой трипсином [23].

1.Проинкубируйте препарат хромосом в растворе 2 х SSC при 60 °С в течение 3 ч (разд. 4.1).

2.Охладите стекла до комнатной температуры, промывая их деионизованной водой.

3.Обработайте препарат хромосом в течение 90с при 10°С солевым раствором трипсина [трипсин Bacto (Difco — 0,9%-ный раствор NaCl, объемное соотношение 1 :99].

4.Промойте стекла деионизованной водой.

5.Окрасьте препарат по Гимза (красителем Гарра, R66), разведенным деионизованной водой в соотношении

1: 10, в течение 5 мин.

6.Промокните стекла, дайте им высохнуть на воздухе и заключите препарат.

По сравнению с двумя методами, изложенными выше, данная методика хороша тем, что с ее помощью сегментация выявляется более четко, чем при использовании просто ASG-метода, кроме того, не нарушается морфология хромосом, что часто происходит под действием трипсина. Так же как и в случае метода Гимза с обработкой трипсином, необходимые для получения оптимальных результатов концентрацию трипсина и

197