§ 5. Clostridium histolyticum.
Эти клостридии были впервые изолированы М. Вайнбергом и П. Сегуином в 1916 г.
Морфология. Это клостридии с протеолитической активностью, которые образуют овальные субтерминальные споры.
Культивирование. Они являются аэротолерантными и некоторый рост их можно наблюдать даже в аэробных условиях.
Ферментативные свойства. Эти бактерии продуцируют фибринолизин.
Токсинообразование. Бактерии образуют минимум 5 различных токсинов: альфа - летальный и некротический, бета - коллагеназу, желатиназу, гамма - протеиназу, желатиназу, дельта - эластазу, желатиназу, эпсилон - кислородлабильный гемолизин.
Патогенез и заболевания человека. Споры выявляют в почве, но редко. У человека эти клостридии вызывают развитие газовой гангрены, но менее часто, чем другие клостридии.
Иммунитет. Иммунитет при анаэробных инфекциях связан преимущественно с наличием антитоксинов, которые противостоят действию большинства этиологических агентов раневой инфекции. Реакция токсина с антитоксином зависит, в основном, от присутствия лецитина, выступающего в качестве субстрата для активности токсина. Антитоксин не может нейтрализовать лецитиназу, если его добавили после того, как токсин контактировал с лецитином, реакция в этом случае задерживается.
§ 6. Clostridium tetani.
C. tetani (столбнячная палочка) является этиологическим агентом столбняка. Столбняк известен с древних времен, его описали Гиппократ и Аретей. Карле и Раттоне заразили столбняком кроликов в 1884 г. Николье при изучении заболевания в эксперименте (1884 г.) предположил, что манифестации столбняка обусловлены продукцией сходного со стрихнином яда бактериями, размножающимися локально. Розенбах в 1886 г. выделил от больного столбняком тонкие бактерии с круглыми терминальными спорами. Окончательно доказал этиологическую роль столбнячной палочки С. Китазато в 1889 г., который изолировал ее в чистой культуре и воссоздал заболевание на животных путем инокуляции чистых культур. Столбнячные палочки часто выделяют из почвы, кишечника людей и животных. Они являются убиквитарными и выделены из многих других источников, включая уличную и больничную пыль, вату, пластырь, перевязочный материал, кетгут, тальк; в некоторых случаях они были идентифицированы как безвредные загрязнители ран.
Морфология. Это грамположительные тонкие клостридии размером 4-8*0,5 мкм, хотя длина может варьировать. Они имеют прямую ось, параллельные стороны и закругленные концы; в мазках располагаются одиночно или цепочками (редко). Споры сферические, терминальные и большие, они придают клостридиям столбняка характерный вид “барабанных палочек”. Морфология спор зависит от стадии их развития, молодые споры могут быть овальными, а не сферическими. Столбнячные палочки не образуют капсул, двигаются за счет перитрихеальных жгутиков. Молодые культуры грамположительные, старые клетки - грамвариабельны и даже грамнегативные.
Культивирование. Столбнячные палочки - строгие анаэробы, которые растут только при отсутствии кислорода. Оптимальной температурой является 37ºC, рН - 7,4. Они растут на простых средах, рост усиливается при добавлении крови или сыворотки, но не глюкозы. Поверхностные колонии при культивировании получить тяжело, поскольку рост имеет тенденцию к распространению по поверхности агара, особенно на влажных средах. Они образуют чрезвычайно тонкие прозрачные пленки, которые являются практически невидимыми, кроме их нитчатых краев. Эта особенность роста позволяет изолировать столбнячные палочки из смешанных культур. Если в конденсированную воду, которая образовалась у основания скоса питательного агара, инокулировать смешанную бактериальную культуру, после инкубации в течение 1 суток можно наблюдать рост чистой культуры столбнячных палочек на поверхности пробирки (техника Филдса). В толще агара колонии имеют вид мохнатых сферических шариков диаметром 1-3 мм, сформированных радиально расположенными нитями. В скошенном агаре рост напоминает елочное дерево с медленным разрежением среды. Столбнячные палочки хорошо растут на мясном бульоне Робертсона с образованием мути и небольшого количества газа; мясо не переваривается, но становится чёрным при продолжительной инкубации. На агаре с лошадиной кровью возникает альфа-гемолиз, позднее переходящий в бета-гемолиз вследствие продукции гемолизина (тетанолизина).
Ферментативные свойства. Столбнячные палочки обладают протеолитической активностью, но не расщепляют ни один из сахаров; образуют индол, не образуют сероводород; медленно разжижают желатин. Тесты с метиленовым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательные. На средах, которые содержат нейтральный красный, образуют зеленоватую флуоресценцию.
Токсинообразование. Столбнячные палочки продуцируют минимум 2 различных токсина- гемолизин (тетанолизин) и мощный нейротоксин (тетаноспазмин), которые являются антигенно и фармакологически различными, а их продукция - независимой. Третий токсин - неспазмогенный нейротоксин с периферической активностью - стимулирует синтез ацетилхолина в нейромышечных синапсах.
Тетанолизин является термо- и кислородлабильным гемолизином, сходным по антигенным признакам с кислородлабильными гемолизинами, которые продуцируются C. perfringens, C. novyi и S. pyogenes. Он вызывает лизис эритроцитов некоторых видов животных, особенно кроликов и лошадей. Его патогенная роль не изучена, возможно, он может действовать как лейкотоксин.
Тетаноспазмин является токсином, ответственным за развитие клинической картины столбняка. Он является кислородстабильным, но относительно термолабильным, нагревание до 65ºС разрушает его через 5 минут. Он кодируется плазмидами; способен спонтанно превращаться в анатоксин в присутствии небольших концентраций формальдегида.
Он является кристаллизующимся антигеном, специфически нейтрализующим антитоксин. Тетаноспазмин - это простой белок, состоящий из одной полипептидной цепи. При высвобождении из столбнячных палочек он автолизируется с образованием гетеродимера, состоящего из тяжёлой цепи (с молекулярной массой 93000) и лёгкой цепи (с молекулярной массой 52000), связанных между собою дисульфидным мостиком. Токсины столбнячных палочек и клостридий ботулизма сходны между собой по аминокислотным последовательностям. Очищенный токсин активен в очень малых концентрациях, MLD для мышей составляет 1-5*10-6/мл, для человека - 130 мкг. Количество токсина зависит от особенностей штамма и типа использованной для культивирования питательной среды. Различные виды животных отличаются по чувствительности к токсину: наиболее чувствительными являются лошади, менее - морские свинки, мыши, козы и кролики; птицы и рептилии - резистентны.
Столбнячные палочки имеют небольшую инвазивность; спора, попавшая в рану, способна превратиться в вегетативное тело и размножаться только в благоприятных условиях. Токсин, продуцируемый локально, адсорбируется двигательными нервными окончаниями и транспортируется к центральной нервной системе вдоль осевых цилиндров периферических нервов. Токсин специфически и сильно связывается ганглиозидами серого вещества нервной ткани. Тетаноспазмин напоминает по своим эффектам стрихнин. Столбнячный токсин специфически блокирует синаптическое торможение в спинном мозге, особенно в участках, где в качестве нейротрансмиттеров выступает глицин. Токсин действует пресинаптически в отличие от стрихнина, действующего постсинаптически.
Блокада спинномозгового торможения приводит к бесконтрольному распространению импульсов, которые возникли в любом участке центральной нервной системы, вследствие чего возникает ригидность мышц и спазмы вследствие спонтанного сокращения агонистов и антагонистов при отсутствии реципрокной ингибиции.
Токсичность тетаноспазмина зависит от пути его попадания в организм. При приеме внутрь он разрушается ферментами пищеварительного тракта и не оказывает отрицательного действия, в отличие от подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций. Введение токсина в нервы или в центральную нервную систему является летальным. Путь попадания токсина определяет клиническую картину: экспериментальный столбняк может быть “локальным”, “восходящим” и “нисходящим” в зависимости от того, как токсин распространился по центральной нервной системе. У людей в природных условиях часто возникает клиническая картина, которая напоминает “нисходящий” столбняк.
Антигенная структура и классификация. На основании реакций агглютинации было выделено 10 серологических типов столбнячных палочек (типы I-Х). Тип VI содержит нежгутиковые штаммы, все другие типы имеют типоспецифические жгутиковые антигены. Все типы продуцируют одинаковый токсин, нейтрализующийся антитоксином, последний продуцируется против любого типа токсина.
Резистентность спор столбнячных палочек к нагреванию зависит от типа штамма: большинство гибнет при кипячении через 10-15 минут, но некоторые выдерживают кипячение в течение 3 часов. Для гарантированного уничтожения спор необходимо автоклавировать материал в течение 20 минут при 121ºC. С другой стороны, для отделения культур столбнячных палочек от неспорообразующих бактерий необходимо нагревать культуры не выше 80ºC в течение 10 минут, и даже это нагревание может вызывать разрушение клостридий столбняка. Споры способны выживать в почве в течение лет и резистентны к действию большинства антисептиков. Они не разрушаются 5 % раствором фенола и 0,1 % раствором хлорида ртути в течение 2 недель и больше, водный раствор йода и 10 % раствор перекиси водорода убивает споры в течение нескольких часов.
Патогенность для животных. Лошади и мелкий рогатый скот болеют столбняком в природных условиях, многие животные являются носителями столбнячных палочек. Среди лабораторных животных чувствительными к столбняку являются белые мыши, морские свинки, крысы, кролики и хомяки.
Патогенез и заболевание человека. Болезнь возникает вследствие инфицирования раны клостридиями столбняка, или, более редко, при парентеральном введении загрязненных веществ, и характеризуется тоническими судорогами мышц, которые обычно начинаются в очаге инфицирования, но даже в легких случаях судороги становятся генерализованными, включают всю соматическую мышечную систему. Часто заболевание возникает после легкого и незаметного ранения; колотые раны наиболее опасны, поскольку они способствуют росту клостридий. Редко столбняк возникает после хирургических вмешательств вследствие несоблюдения правил асептики. Иногда заболевание возникает вследствие локального нагноения, такого, как отит среднего уха (отогенный столбняк). Столбняк являются тяжёлым осложнением септических абортов.
Простое загрязнение раны спорами не всегда приводит к развитию столбняка. Если нет анаэробных условий, споры остаются покоящимися. Разрушение и некроз тканей, недостаточное дренирование инфицированного участка, наличие чужеродных частиц (особенно почвы), ассоциации клостридий с другими бактериями способствуют развитию столбняка. Споры иногда могут оставаться интактными в течение продолжительного времени в очаге проникновения и внезапно превращаться в вегетативные тела в этом очаге или в другом месте при возникновении благоприятных условий.
Инкубационный период составляет от 2 дней до нескольких недель (обычно 6-12 дней). На продолжительность инкубационного периода влияют несколько факторов: локализация и происхождение раны, доза и токсигенность контаминирующего микроба и иммунное состояние микроорганизма. Продолжительность инкубационного периода имеет прогностическое значение - чем он короче, тем более серьезен прогноз. Такое же значение имеет интервал между появлением первого симптома болезни (тризма) и началом судорог (период разгара). До появления методов специфического лечения столбняк был тяжёлым заболеванием с высоким уровнем смертности (80-90 %). Даже при надлежащем лечении уровень летальности составляет 15-50 %. Наиболее тяжёлыми в плане летального исхода являются столбняк новорожденных и столбняк матки (70-100 %), отогенный столбняк имеет более лёгкое течение. Столбняк более распространён в странах с низким уровнем экономического развития и теплым климатом; в сельскохозяйственных районах, где почва хорошо плодоносит и постоянно культивируется, люди и животные живут в тесной связи между собою и имеют место нарушения санитарно-гигиенических норм.
Иммунитет. Выздоровление после перенесенного столбняка не всегда обеспечивает возникновение иммунитета к реинфекции, лиц, которые переболели столбняком, следует вакцинировать столбнячным анатоксином.
Лабораторная диагностика. Диагноз столбняка следует всегда ставить на основании клинических данных. Лабораторные тесты следует использовать только для подтверждения диагноза. Иногда совсем невозможно поставить лабораторный диагноз. Столбнячные палочки можно выявить путем микроскопии, культивирования или инокуляции животным (белым мышам). Выявление при микроскопии типичных “барабанных палочек” в ранах само по себе не означает развития столбняка, ибо похожими на столбнячные палочки являются C. tetanomorphum и C. sphenoides. Для культивирования следует использовать нарезанные кусочки тканей с некротизированных участков ран, а не смывы с поверхности. Материал для исследования инокулируют на половину чашки с кровяным агаром. Рост столбнячных палочек можно выявить на второй половине чашки после инкубации в анаэробных условиях в течение 1-2 дней. Материал также вносят в 3 пробирки с мясным бульоном, одну из которых нагревают до 80ºC в течение 15 минут, вторую - в течение 5 минут, третью не нагревают совсем. Целью нагревания в течение разного времени является уничтожение вегетативных бактерий, тогда как споры столбняка не гибнут, поскольку очень отличаются по устойчивости к действию высоких температур. Затем пробирки с агаром инкубируют при 37ºС и культивируют на половине чашки с кровяным агаром до 4 дней. Столбнячные палочки можно изолировать в чистой культуре путем субкультивирования нитей по краю роста. Внесение в среду полимиксина В, к которому клостридии резистентны, делает её более селективной.
Для идентификации и определения токсигенности Лоубери и Лилле предложили использовать чашки с агаром, содержащим 4 % лошадиной крови: на половину каждой чашки наносят антитоксин (1500 единиц в 1 мл), а культуру столбнячных палочек наносят на всю поверхность чашек, после чего их инкубируют в анаэробных условиях в течение 2 дней. Токсигенные клостридии столбняка образуют зоны гемолиза вокруг колоний только на половине чашки без антитоксина; на второй половине антитоксин угнетает лизис. Этот тест позволяет идентифицировать столбнячные палочки, но не их токсигенность, поскольку он отображает продукцию только тетанолизина, а не тетаноспазмина, также являющегося патогенным токсином.
Лечение. Больных столбняком следует лечить в условиях стационаров, желательно в специализированных отделениях. Необходимость их изоляции обусловлена тем, что шум и свет могут спровоцировать развитие конвульсий. Больные столбняком являются незаразными, передача столбняка от одного человека к другому никогда не наблюдалась. Лечение заключается в обеспечении тишины, контроле судорог, поддержании проходимости дыхательного тракта путем проведения трахеотомии. Следует вводить противостолбнячный человеческий иммуноглобулин человека в дозе 10000 МЕ медленно внутривенно, и позже, при необходимости, еще 5000 МЕ: если он даже не нейтрализует токсин, который уже связался с нервной тканью, он может обезвредить несвязанный токсин.
Профилактика. Столбняк являются заболеванием, развитие которого можно предотвратить. Поскольку споры являются убиквитарными, невозможно предотвратить загрязнение ран. Заболевание возникает вследствие действия токсина, и, таким образом, наиболее очевидным и надежным методом профилактики является создание антитоксического иммунитета путем активной иммунизации. Выбор метода профилактики зависит от типа раны и иммунного статуса больного, существуют следующие способы: (1) первичная хирургическая обработка, (2) антибиотикотерапия и (3) иммунизация - пассивная, активная или комбинированная. Целью первичной хирургической обработки является удаление чужеродных частиц, некротизированных тканей и кровяных сгустков для предотвращения создания анаэробных условий. Объем хирургического вмешательства может варьировать от простой очистки до радикальной эктомии, в зависимости от типа раны. Целью антибиотикопрофилактики является разрушение или угнетение роста клостридий столбняка и гноеродных бактерий в ранах для предупреждения продукции ними токсина. Препаратом выбора является пенициллин, можно использовать эритромицин, локально - бацитрацин и неомицин. Антибиотики следует назначать до первичной обработки раны; они не влияют на токсин и не заменяют иммунизацию. Пассивную иммунизацию проводят путем введения 3000 МЕ противостолбнячной сыворотки по Безредке. Активную иммунизацию проводят путем введения столбнячного анатоксина взрослым (трижды, внутримышечно, с интервалом 4-6 недель между первыми двумя инъекциями) или коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины детям. Полный курс иммунизации обеспечивает стойкий иммунитет в течение 10 лет, после чего следует провести бустер-инъекцию (многоразовое введение антигена с целью стимуляции синтеза антител).
При ранении непривитых лиц следует проводить активно-пассивную иммунизацию: ввести подкожно 0,5 мл столбнячного анатоксина и внутримышечно 3000 МЕ противостолбнячной сыворотки или 3 мл противостолбнячного иммуноглобулина.