Тема 2: гистологическая техника

Содержание

Основные принципы приготовления препаратов для световой и электронной микроскопии, взятие материала (биопсия, игловая пункционная биопсия, аутопсия). Фиксация, обезвоживание, уплотнение объектов, приготовление срезов на микротомах и ультрамикротомах. Виды мипрепаратов - срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф. Окрашивание и контрастирование препаратов. Понятие о гистологических красителях.

Микроскопическая техника.

Главные этапы цитологического и гистологического анализа:

- выбор объекта исследования

- подготовка его для изучения в микроскопе

- применение методов микроскопирования

- качественный и количественный анализ полученных изображений

Методы, применяемые в гистологической технике:

1. Прижизненные.

2. Посмертные.

I прижизненные методы

Целью прижизненных исследований является получение информации о жизнедеятельности клетки: движение, деление, рост, дифференцировка, взаимодействие клеток, продолжительность жизни, разрушение, реактивные изменения под действием различных факторов.

Исследование живых клеток и тканей возможно вне организма (in vitro) или внутри организма (in vivo).

А. Исследование живых клеток и тканей в культуре (in vitro) –

Метод культивирования

Различают: а)суспензионные культуры (клетки, взвешенные в питательной среде), б)тканевые, в)органные, г)монослойные.

Метод культивирования ткани вне организма является самым распространенным. Культивировать ткань можно в специальных прозрачных герметически закрытых камерах. В стерильных условиях в камеру помещают каплю питательной среды. Наилучшей питательной средой является плазма крови, к которой добавляют эмбриональный экстракт (вытяжка из тканей зародыша, содержащая большое количество веществ, стимулирующих рост). Туда же помещают кусочек органа или ткани (не более 1 мм3), которые необходимо культивировать.

Выдерживать культивируемую ткань следует при температуре тела организма, ткань которого взята для исследования. Так как питательная среда быстро приходит в негодность (в ней накапливаются продукты распада, выделяемые культивируемой тканью), то каждые 3-5 дней ее нужно менять.

Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток между собой, а также с вирусами и микробами. Культивирование эмбриональных тканей позволило изучить развитие кости, хряща, кожи и др.

Особую значимость метод культивирования имеет для проведения экспериментальных наблюдений на клетках и тканях человека, в частности для определения пола, злокачественного перерождения, наследственных заболеваний и др.

Недостатки метода:

1. Главным недостатком этого метода является то, что ткань либо орган исследуется в отрыве от организма. Не испытывая нейрогуморального влияния организма, она теряет присущую ей дифференцировку.

2. Необходимость частых пересадок (при длительном культивировании).

3. Одинаковый коэффициент лучепреломления тканей.

Б. Прижизненное исследование клеток в организме (in vivo)

1. Наблюдение структур в живом организме. Пример: с помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюминаторов можно наблюдать циркуляцию крови в микрососудах.

2. Метод вживления прозрачных камер в организм животного. Исследуемый объект помещается в прозрачную камеру (снабженную микроотверстиями для осуществления обмена веществ) и вживляется, чаще всего, в ушную раковину экспериментального животного. С помощью микроскопа можно наблюдать динамику изменения клеток и тканей в течение длительного времени.

3. Метод использования естественных прозрачных камер экспериментального животного, например передней камеры глаза, расположенной между роговицей и радужкой. Такой метод был использован для изучения ранних стадий развития зародыша, циклических изменений эндометрия и др.

4. Метод трансплантации – широко используется для изучения кроветворения. Клетки крови и костного мозга от здоровых животных пересаживаются животным, подвергнувшимся смертельному облучению. Экспериментальные животные выживают вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток (метод колониеобразования). Этим методом установлены источники развития для всех клеток крови.

Так как ткани в организме имеют приблизительно одинаковый коэффициент лучепреломления, то иногда с целью их дифференцировки прибегают к использованию прижизненных красителей.

К прижизненным красителям относятся: метиленовый синий, трипановый синий, конго-красный.

Прижизненные красители должны отвечать следующим требованиям:

1. Быть безвредными для организма.

2. Быстро выводиться из организма.

Окрашивание живых объектов имеет две разновидности:

1. Витальное (прижизненное окрашивание) - краситель вводят в организм животного, где он избирательно связывается с определенными клетками, органеллами, межклеточным веществом… Например, трипановый синий или литиевый кармин выявляют фагоциты; ализарин – новообразованный матрикс кости.

2. Суправитальное окрашивание – окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом красителем бриллиантовым крезиловым синим выявляются молодые эритроциты (ретикулоциты), янусом зеленым – митохондрии, нейтральным красным – лизосомы.