14. Основные результаты исследования генома человека. Методы днк диагностики. Генетические маркеры. Банк генов. Клонотека.

Методы ДНК диагностики

Пуповинная кровь, в состав которой входят стволовые клетки, макрофаги, лимфоциты, ретикулоциты - собирается во время родов.

Клетки пуповинной крови используют для молекулярно-генетической диагностики, которая позволяет выявить поврежденные гены и оценить риски развития наследственных болезней, выявить носительство заболевания и назначить своевременную терапию и диету. Остальные методы только уточняют и дополняют результаты генетической диагностики. Из части этих клеток выделяется ДНК. В диагностике по программе «Гемаскрин» используются два основных метода: полимеразная цепная реакция (ПЦР) и автоматическое секвенирование.

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК при помощи ферментов, в результате чего получают достаточное для исследования количество ДНК человека. Это дает возможность существенно повысить точность ДНК-диагностики. Секвенирование представляет собой определение нуклеотидной последовательности определенного гена и ее автоматический анализ.

Программа ДНК диагностики разработана в партнерстве с лучшими специалистами России по медицинской генетике. Все работы проводятся в лицензированной лаборатории, соответствующей стандартам.

Методы диагностики "Гемаскрин" отличаются высокой точностью и быстротой проведения анализа, в отличие от биохимического скрининга, который лишь с той или иной долей вероятности предсказывает патологию и требует дополнительной диагностики

Под генетическими маркерами понимают любые наследуемые фенотипические признаки, различающиеся у отдельных особей.

Фенотипические признаки, отвечающие требованиям генетических маркеров, весьма разнообразны. Они включают в себя как особенности поведения или предрасположенность к определенным заболеваниям, так и морфологические признаки целых организмов или их макромолекул, различающихся по структуре. Молекулярные маркеры используются при построении генетических карт сцепления.

Библиотека (банк) генов, клонотека — это набор фрагментов ДНК, в котором представлены все (или определенная часть) генов организма. Библиотека генов представляет собой совокупность культур микроорганизмов (бактерий, дрожжей), в каждую клетку которых введен вектор, несущий один из фрагментов генома организма.

Библиотеку генов можно длительно хранить (в замороженном состоянии) и, по необходимости, выделять отдельные микроорганизмы, содержащие фрагменты ДНК с нужными генами, и размножать (клонировать) их. Клонированные таким способом гены выделяют из клеток и используют для решения различных теоретических и практических задач генетики, медицины (в том числе диагностики наследственных болезней) и биотехнологии.

15. Генно-инженерные технологии. Трансгенные организмы, применяемые в фармации и медицине. Клонирование.

Генная, или генетическая инженерия (genetic engineering, genetic modification technology) – это совокупность биотехнологических методов, позволяющих создавать синтетические системы на молекулярно-биологическом уровне

Генная инженерия дает возможность конструировать функционально активные структуры в форме рекомбинантных нуклеиновых кислот: рекДНК (recDNA) или рекРНК (recRNA) – вне биологических систем (in vitro), а затем вводить их в клетки.

Возможность прямой (горизонтальной) передачи генетической информации от одного биологического вида другому была доказана в опытах Ф. Гриффита с пневмококками (1928).

Однако генная инженерия как технология рекДНК возникла в 1972 г., когда в лаборатории П. Берга (Станфордский ун-т, США) была получена первая рекомбинантная (гибридная) ДНК (рекДНК), в которой были соединены фрагменты ДНК фага лямбда и кишечной палочки с кольцевой ДНК обезьяньего вируса SV40.

С начала 1980-х гг. достижения генной инженерии начинают использоваться на практике.

С 1996 г. генетически модифицированные растения (genetic modified plants) начинают использоваться в сельском хозяйстве.

Задачи генной инженерии

Основные направления генетической модификации организмов:

– придание устойчивости к ядохимикатам (например, к определенным гербицидам);

– придание устойчивости к вредителям и болезням (например, Bt-модификация);

– повышение продуктивности (например, быстрый рост трансгенного лосося);

– придание особых качеств (например, изменение химического состава).

Методы генной инженерии

Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации.

Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов:

– Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз).

– Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов.

– Синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

Выделенные участки ДНК встраивают в векторы переноса ДНК. Векторы ДНК – это небольшие молекулы ДНК, способные проникать в другие клетки и реплицироваться в них.

В состав вектора ДНК входит не менее трех групп генов:

1. Целевые гены, которые интересуют экспериментатора.

2. Гены, отвечающие за репликацию вектора, его интеграцию в ДНК клетки-хозяина и экспрессию требуемых генов.

3. Гены-маркеры (селективные, репортерные гены), по деятельности которых можно судить об успешности трансформации (например, гены устойчивости к антибиотикам или гены, отвечающие за синтез белков, светящихся в ультрафиолетовом свете).

Для внедрения векторов в прокариотические или эукариотические клетки используют различные способы, например:

1. Биотрансформация. Используются векторы, способные сами проникать в клетки. Частным случаем биотрансформации является агробактериальная трансформация.

2. Микроинъекции. Используются, если клетки, подлежащие трансформации, достаточно крупные (например, икринки, пыльцевые трубки).

3. Биобаллистика (биолистика). Векторы «вбивают» в клетки с помощью специальных «пушек».

4. Комбинированные методы, например, сочетание агробактериальной трансформации и биолистики.

В качестве векторов часто используют плазмиды (кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток), а также ДНК вирусов. У эукариот в качестве векторов используют мобильные генетические элементы – участки хромосом, способные образовывать множество копий и встраиваться в другие хромосомы. В составе одного вектора можно комбинировать различные фрагменты ДНК (различные гены). Вновь образованные фрагменты ДНК называют рекомбинантными.

Векторы переноса ДНК вместе с внедренными фрагментами ДНК различными способами вводят в прокариотические или эукариотические клетки и получают трансгенные клетки. В ходе размножения трансгенных клеток происходит клонирование требуемых фрагментов ДНК, в частности, отдельных генов. Клонированные гены эукариот подвергают различным модификациям (например, добавляют перед ними определенные промоторы) и внедряют в клетки-продуценты. Основная проблема состоит в том, чтобы чужеродные гены экспрессировались постоянно, то есть должен происходить синтез необходимых веществ без ущерба для клетки–хозяина.

Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем:

– Созданы банки генов, или клонотеки, представляющие собой коллекции клонов бактерий. Каждый из этих клонов содержит фрагменты ДНК определенного организма (дрозофилы, человека и других).

– На основе трансформированных штаммов вирусов, бактерий и дрожжей осуществляется промышленное производство инсулина, интерферона, гормональных препаратов. На стадии испытаний находится производство белков, позволяющих сохранить свертываемость крови при гемофилии, и других лекарственных препаратов.

– Созданы трансгенные высшие организмы (многие растения, некоторые рыбы и млекопитающие) в клетках которых успешно функционируют гены совершенно других организмов. Широко известны генетически защищенные генно-модифицированные растения (ГМР), устойчивые к высоких дозам определенных гербицидов, а также Bt-модифицированные растения, устойчивые к вредителям. Среди трансгенных растений лидирующие позиции занимают: соя, кукуруза, хлопок, рапс.

КЛОНИРОВАНИЕ, воспроизведение генетически однородных организмов (клеток) путём бесполого (вегетативного) размножения. При клонировании исходный организм (или клетка) служит родоначальником клона – ряда организмов (клеток), повторяющих из поколения в поколение и генотип, и все признаки родоначальника. Таким образом, сущность клонирования заключается в повторении одной и той же генетической информации. В основе точного копирования генетического материала (и организма в целом) у эукариотических клеток лежит митоз (у бактерий – простое деление). В многоклеточном организме, зародившемся в результате полового процесса, все клетки, несмотря на их различия и специализацию, представляют собой клон, развившийся из оплодотворённой яйцеклетки. Однако такой организм-клон и генетически, и своими признаками будет отличаться от родительских организмов.

Благодаря бесполому (вегетативному) размножению многоклеточный организм может развиться из одной соматической (неполовой) клетки, из группы таких клеток или из части родительского организма. В природе такое размножение, или клонирование, широко распространено у грибов, водорослей, простейших, а также у многих высших растений. У многоклеточных животных клонирование возможно либо в форме почкования, либо как деление тела животного на части и восстановление каждой части до целого организма. Так могут размножаться кишечнополостные, губки, многие черви, мшанки, а из хордовых – оболочники. Классический, издавна известный пример животного, которое, будучи разделено на десятки и даже сотни частей, способно к воссозданию (регенерации) из каждой части целого организма – гидра. Естественное клонирование позвоночных животных встречается редко и возможно, по-видимому, только на ранних стадиях зародышевого развития. Так, однояйцевые близнецы у животных и человека происходят от одной оплодотворённой яйцеклетки в результате её митотиче-ского разделения, т. е. клонирования. Подобное клонирование характерно для броненосцев, у которых обычны однояйцевые двойники.

Искусственное, т. е. осуществляемое человеком, клонирование широко применяется как в научных, так и в практических целях. Наряду с различными способами вегетативного размножения, известными с древности, в растениеводстве всё шире входит в практику т. н. микрораз-множение – выращивание посадочного материала из одиночных клеток с применением методов культуры клеток и тканей. Клонирование бактерий и соматических клеток растений и животных используется в микробиологии, в генетике, в практических направлениях биотехнологии и клеточной инженерии, во всех тех теоретических и практических работах, когда необходимо иметь генетически однородный материал.

Особый интерес вызывают эксперименты, связанные с клонированием позвоночных животных и человека. Исследования в этом направлении ведутся давно. В 1987 г. отечественные учёные в Пущинском научном центре осуществили первое клонирование млекопитающего – мыши. Для этого из яйцеклетки мыши удаляли ядро, а затем вводили в яйцеклетку ядро из эмбриональной мышиной клетки. Т. е. был использован генетический материал соматической, но недифференцированной (неспециализированной) эмбриональной клетки. В 1997 г. шотланд-ским учёным удалось клонировать овцу, используя в качестве донора генетического материала эпителиальные клетки молочной железы. Зародыш вводили (имплантировали) в организм приёмной матери, которая и вынашивала ягнёнка. В этом случае, что представляет принципиальный интерес, использовалась в качестве донора специализированная соматическая клетка. Таким образом, эти эксперименты доказали, что можно получать генетически идентичные копии (клоны) млекопитающих, используя их соматические клетки.

Предполагается, что клонирование найдёт широкое применение в животноводстве. В принципе не представляется невероятным выращивание из хорошо сохранившихся в вечной мерзлоте соматических клеток вымерших животных (напр., мамонта) полноценного организма. Эксперименты по клонированию человека осуждаются международными организациями и запрещены в ряде стран как неприемлемые в нравственном отношении. Тем не менее в кон. 2002 г. в мире появились неподтвержденные сообщения о рождении детей, клонированных из соматических клеток.

В генной инженери и клонирование – получение копий определённых участков ДНК (генов).