“Ложно-положительные” ошибки в тсх
Ошибки второго типа могут возникать если вещество модифицируется в умеренной степени в процессе анализа непосредственно на пластинке, причем, такая модификация может быть как обратимой, так и необратимой. Наиболее ярким примером обратимой модификации анализируемого вещества является наличие “загадочной” примеси в амиксине при анализе его на пластинках Silufol с применением элюента состава бензол – хлороформ – этанол – водный аммиак (5:3.5:1.5:0.5). В этих условиях непосредственно под пятном амиксина (разница Rf 0.05 – 0.1) наблюдается слабоокрашенное пятно, которое не удавалось сопоставить ни с одной из возможных (исходя из технологии получения) примесей. Этот элюент отличался неустойчивостью и в ряде случаев расслаивался. В связи с этим, водный аммиак, использовавшийся при его приготовлении, был заменен таким же объемом насыщенного раствора аммиака в этаноле. В этом случае “загадочное” пятно оказывалось еще более интенсивным. Все попытки “очистить” амиксин от этой “примеси” оказались безуспешными. Для установления характера этой примеси было проведено препаративное разделение 7 г “загрязненного” амиксина на 120 пластинкахс толщиной слоя 2 – 5 мм. Амиксин и загадочная “примесь” четко разделялись на пластинках, причем, между их зонами оставалось полоса чистого сорбента приблизительно полуторасантиметровой ширины. Эвакуацией зон амиксина и “примеси” с последующей элюцией их с сорбента было выделено 6.5 г “чистого” амиксина и 0.5 г “примеси”. И хроматографический и масс-спектральный анализ показали полную идентичность амиксина и “примеси”. Анализ особенностей химической структуры амиксина и возможных его реакций с компонентами элюента привел к предположению о возможности обратимого присоединения аммиака к карбонильной группе амиксина.
Образующийся при этом -гидроксиамин стабилизируется взаимодействием кислорода гидроксильной группы с сорбентом. При удалении этого вещества с сорбента и упаривании его раствора равновесие смещается в сторону образования амиксина и аммиака, который удаляется вместе с растворителем. Справедливость этого предположения подтверждается тем, что замена аммиака третичным амином привела к заметному “уменьшению” содержания “примеси”. В результате ряда экспериментов было установлено, что наиболее надежные результаты хроматографического анализа амиксина получаются при применении в качестве элюента смеси бензола с триэтиламином и метанолом в соотношениях 10:1:0.1. Незначительные количества метанола в этом элюенте служат для предотвращения образования аддукта амиксина с триэтиламином, который, хотя и образуется в гараздо меньших количествах, чем с применением аммиака, регистрируется под УФ-облучением.
В качестве примера необратимой модификации анализируемого вещества в процессе хроматографирования можно привести диспропорционирование гидразона амиксина до соответствующего азина и гидразина (образование гидразина гипотетично – его не обнаруживали специально) при хроматографировании на силикагеле и образование флуоренона и азота (предположительно) при хроматографировании на окиси алюминия.
Ошибки этого типа уверенно разрешаются двумерной хроматографией с применением одного и того же элюента в обоих направлениях. Образование на двумерной хроматограмме “квадрата” (4 пятна, расположенных по углам прямоугольника) свидетельствует о наличии обратимой модификации. Образование “треугольника” (3 пятна, образующих вершины прямоугольного треугольника) свидельствуют о необратимой модификации. Образование “диагонали” (2 пятна, расположенных на прямой, приблизительно совпадающей с диагональю пластинки) свидетельствуют об отсутствии трансформации анализируемого вещества в процессе хроматографирования и однозначно указывают на наличие реальной примеси.
В ряде случаев вещество претерпевает трансформацию на поверхности сорбента не в процессе элюции, а при выдерживании пластинки на воздухе (в отсутствии органического растворителя). Так было замечено, что арилакридинилгидразины в виде свободных оснований на поверхности силикагеля весьма быстро (в 20 – 100 раз быстрее,чем в растворе) окисляются до 9-арилазоакридинов.
Эфиры акридиниламинокислот подвергаются гидролизу адсорбированной водой на поверхности силикагеля до соответствующих кислот, причем, скорость гидролиза значительно зависила от строения аминокислоты.
Эти примеры показывают, что время между нанесением образца на пластинку и элюцией может также являться источником ошибок. Если для проявления хроматограммы используется обработка специфическими реактивами, то существенным может оказаться и время между окончанием элюции и проявлением хроматограммы.