Тема 20.1. Микробиологическая диагностика кишечных вирусных инфекций и вирусных гепатитов

А План

а Программа

Биологические свойства возбудителей кишечных ви­русных инфекций и вирусных гепатитов, их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

Микробиологическая диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

а Демонстрация

Реакция преципитации в агаре (встречная диффузия в геле по Оухтерлони) для обнаружения HBs-антигена в сыворотке крови больного вирусным гепатитом В.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

а Задание студентам

Указать материал для исследования,

Учесть результаты выявления специфических HBs-антигенов в сыворотке крови больного с помощью РИГА.

Учесть результаты выявления специфических HBs-антигенов в сыворотке крови донора с помощью иммуноферментного метода.

Учесть результаты выявления анти-НВз-антител в сы­воротке крови больного с помощью РИГА. Оценить нарастание титра анти-НВз-антител в динамике забо­левания.

Учесть результаты выявления в сыворотке больного IgM против вируса гепатита А.

6. Дать краткую характеристику демонстрируемым диа­гностическим, профилактическим и лечебным пре­паратам.

а Методические указания

• Микробиологическая диагностика кишечных вирусных ин­фекций

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Является одним из веду­щих методов диагностики кишечных вирусных инфекций. Зре­лые вирионы в испражнениях можно обнаружить с помощью метода электронной микроскопии.

Вирусологическое исследование. Применяют исключительно с целью диагностики эпидемий и вспышек кишечных вирус­ных инфекций. Для выделения реовирусов и ротавирусов из испражнений используют различные типы клеточных культур (HeLa, первичные культуры клеток почек обезьян и др.). Ин­дикацию осуществляют по ЦПД, которое развивается в течение 3 нед и характеризуется появлением внутрицитоплазматичес-ких включений и неспецифической дегенерацией клеток. Ве­дущим методом идентификации и типирования является ана­лиз фрагментов вирусной РНК методом электрофореза. Выде­ление чистой культуры вирусов ECHO — см. главу 9. Кишеч­ные коронавирусы, калицивирусы, астровирусы и аденовирусы не удается культивировать in vitro.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. Присутствие антигенов вирусов в испражнениях можно определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов) и чувствительных серологических реакций (латекс-агглютинации, ИФА, РИФ и др.).

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные НК в испражнениях можно обнаружить с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Серодиагностика при кишечных вирусных инфекциях малоинформативна и применяется преимуществен­но с целью ретроспективной диагностики и для оценки эпи­демиологической ситуации. Для определения противовирусных антител в крови пациента применяют различные серологичес­кие реакции (РИГА, ИФА, РИА и др.). Ретроспективную диа­гностику осуществляют методом парных сывороток. Диагнос­тическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. Выявление (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM) свидетельствует об активной инфекции.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита А

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, испражнения.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Зрелые вирионы в испраж­нениях можно обнаружить с помощью метода электронной микроскопии.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Присутствие антигенов вируса в испражне­ниях можно определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов) и чувствительных серологических реакций ИФА, РИА и др. В типичных случаях вирус гепатита А удается обнаружить в фекалиях за 10—14 дней до появления клини­ческих признаков заболевания. Вирус продолжает выделяться с испражнениями в течение 2—3 нед после начала желтухи.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные нуклеиновые кислоты в крови пациента на ранних сроках болезни обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зон­дов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита А. Для определения противовирусных ан­тител в крови пациента применяют различные серологические реакции (РИГА, ИФА, РИА и др.). Серодиагностику осущест­вляют методом парных сывороток (диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза) или на основании выявления (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM), свидетельствующих об активной инфекции. Последние присутствуют в сыворотке крови с первых дней заболевания и исчезают не ранее чем через 3—4 мес.

Для выявления IgM против вируса гепатита А используют различные варианты ИФА. Противовирусные IgM можно вы­явить следующим способом: на первом этапе на стенках лунок пластиковых планшетов адсорбируют антитела против челове­ческих IgM, на втором этапе в лунки вносят испытуемую сыворотку в различных разведениях. Фиксированные анти-IgM-антитела связывают все IgM сыворотки, в том числе и противовирусные антитела. Далее вносят стандартный антиген вируса гепатита А и меченые антитела против этого антигена. После инкубации и тщательного промывания буферным рас­твором с детергентами в лунки добавляют субстрат и хромоген. В положительном случае через несколько минут наблюдается появление окраски.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита В

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, биоптат печени.

Период болезни HBs HBc HBe Аг at at at at Инкубационный период + — — + — Продромальный период + — ± (IgM) + — Острый период + — + (IgM) + — Реконвалесценция: ранняя — — + — ± поздняя — + + (IgG) — + Хроническая активная форма + ± + (IgG) + ± Хроническая бессимптомная + — — — ± форма (носительство)

чально на поверхности твердой фазы (полимера) адсорбируют ати-HBs-антитела из стандартной сыворотки. Обычно исполь­зуют лунки микротитрационных панелей. На втором этапе в отмытые лунки вносят исследуемую сыворотку крови больного. При наличии ДДу-антигена он связывается фиксированными на твердой фазе антителами. На третьем этапе добавляют анти-ЯЯ5-антитела, несущие ферментную метку. В качестве метки используют фермент пероксидазу. Для выявления связанных антигеном меченых антител в отмытые лунки добавляют суб­страт — пероксид водорода и хролюген — ортофенилендиамин, который окисляется в присутствии кислорода, вьщеляющегося при разложении пероксида водорода под воздействием фер­мента с образованием продуктов желто-коричневого цвета. Степень окраски отражает интенсивность связывания меченых антител, которая пропорциональна количеству HBs-антигена в исследуемой сыворотке.

Реакции РИГА, ИФА, РИА и другие могут быть использованы и для выявления Д#е-антигена в исследуемой сыворотке.

В биоптатах печени при активной форме инфекции можно выявить наличие НВс-антигена, ассоциированного с гепатоци-тами, методом ИФ.

Молекулярно-биологические исследования. Ви­русные ДНК в крови пациента обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. На разных стадиях заболевания и при раз­ных формах инфекции (острой, хронической, вирусоноситель-стве) в крови присутствуют антитела к разным антигенам ви­руса гепатита В (HBs, HBc, НВё), что используют с целью диагностики (см. табл. 20.1.1). Для определения антител при­меняют различные серологические реакции: РИГА, ИФА, РИА и др. (см. выше).

Так, для выявления анти-Я5е-антител в исследуемой сыво­ротке необходим соответствующий эритроцитный диагности-кум — эритроциты, нагруженные стандартным Я#е-антигеном. Реакцию, как правило, ставят с парными сыворотками. В тесте ИФА на поверхности твердой фазы адсорбируют стандартный НВе-антиген, на втором этапе вносят исследуемую сыворотку в десятикратных разведениях, инкубируют, отмывают и добав­ляют меченую антиглобулиновую сыворотку.

Выявление антител к Ш?с-антигену свидетельствует об ак­тивной инфекции и является одним из методов контроля крови доноров. Определение анти-Я#с IgM является ведущим мето­дом дифференциальной диагностики острого и хронического активного вирусного гепатита В.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита С МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. 316

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики. Молекулярно-биологи-ческие исследования. Вирусную РНК в крови пациента обнаруживают с помощью ПЦР или методом ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики хронического вирусного гепатита С и контроля крови доноров. Противовирусные антитела в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.) с рекомбинантным вирусным антигеном. Необходимо иметь в виду, что в остром периоде заболевания антитела в крови присутствуют в низком титре и часто в комплексе с антигеном, поэтому их выявление не всегда удается.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита D

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. Присутствие дельта-антигена в крови можно определить с помощью чувствительных серологических реак­ций ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ную НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита D и контроля крови доноров. Антитела к дельта-антигену в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.).

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита G МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования:

Иммунохимические исследования. Присутствие анти­генов вируса гепатита G в крови можно определить с помощью чувствительных серологических реакций ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ную НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита G и контроля крови доноров. Антитела к антигенам вируса гепатита G в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.).

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита Е

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, испражнения, желчь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Зрелые вирионы в испраж­нениях и желчи можно обнаружить с помощью метода элек­тронной микроскопии.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические иссле­дования. Присутствие антигенов вируса в испражнениях мож­но определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов).

Молекулярно-биологические исследования. Ви­русную НК в исследуемом материале обнаруживают с помо­щью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита Е. Противовирусные антитела в крови па­циентов определяют с помощью чувствительных серологичес­ких реакций (ИФА, РИА и др.). Серодиагностику осуществля­ют методом парных сывороток (диагностическое значение име­ет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза) или на основании выявления (методом ИФА) специ­фических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM), свидетельствующих об активной инфекции.

• Микробиологическая диагностика желтой лихорадки МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики. Молекулярно-биологи­ческие исследования. Вирусные нуклеиновые кислоты в исследуемом материале можно обнаружить с помощью ПЦР.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики желтой лихорадки. Противовирусные антитела в крови паци­ентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (РСК, РТГА, ИФА, РИА и др.). Серодиагностику осуществляют методом парных сывороток (диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза) или на основании выявления (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM), свидетельствующих об активной инфекции.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Стандартный Я&-антиген. Применяют для серодиагностики вирусного гепатита В.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получают из крови человека (донорской, плацентарной) путем фракциони­рования. Применяют для профилактики вирусного гепатита А при контакте (создание пассивного иммунитета).

Вакцина субъединичная против гепатита В. Получена генно-инженерным путем, содержит HBs-антиген вируса гепатита В. Применяют для создания активного иммунитета с целью профилактики вирусного гепатита В. Вводят парентерально контингентам риска.

Иммуноглобулин человеческий анти-Я1?К Получают путем фракционирования из крови доноров с высоким титром ан­тител к вирусу гепатита В. Применяют для профилактики вирусного гепатита В при контакте (создание пассивного иммунитета).

Вакцина живая ослабленная против желтой лихорадки. Со­держит авирулентный штамм вируса желтой лихорадки. При­меняют для профилактики желтой лихорадки (создание актив­ного иммунитета). Вводят контингентам риска.

Противовирусные препараты: интерферон человеческий лейко­цитарный; интерферон рекомбинантный. Применяют для лече­ния вирусного гепатита С.