4.3. Предварительная обработка антигенов перед иммунизацией

а) Токсичные антигены часто подвергают денатурации нагреванием или добавлением денатурирующих агентов (мочевины, гуанидилхлорида и др.). Токсичность при этом снижается (не всегда), но утрачиваются многие антигенные детерминанты, присущие неденатурированному (нативному) антигену. В результате получаемые монАТ узнают лучше денатурированный антиген.

б) Иногда молекулы антигена сшивают друг с другом (полимеризуют) с целью увеличения молекулярного веса и/или уменьшения токсичности.

в) Вирусы и бактерии перед иммунизацией, как правило, инактивируют нагреванием, либо обработкой фенолом, формальдегидом, глутаральдегидом и др. для уменьшения их токсичности и эпидемиологической опасности. Грамотрицательные бактерии, кроме того, иногда обрабатывают лизоцимом, чтобы убрать ЛПС с их поверхности и обеспечить иммунный ответ против бактериальных белков.

5. Гибридизация в-лимфоцита с клеткой миеломы.

Отцы гибридомной технологии Келер и Мильштейн добивались слияния клеток при помощи вируса Сендай. Сейчас для этой цели все используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), как более удобное, эффективное и безопасное средство. Формула ПЭГ:

HO(CH2CH2O)n CH2CH2OH , молекулярный вес ПЭГ, пригодного для слияния, от 20 до 20000, но чаще используют ПЭГ массой 600-6 000.

Полиэтиленгликоль токсичен для клеток, и его токсичность возрастает с уменьшением молекулярного веса. Слияние клеток происходит во время инкубации их в 35-50% ПЭГ, время инкубации зависит от концентрации ПЭГ и от его молекулярного веса (для 50% ПЭГ мол. веса 1 500 это приблизительно 1 минута). Недостаточное время инкубации приведут к очень низкому проценту слившихся клеток, а избыточное- к большому проценту погибших клеток вследствие токсичности ПЭГ. Хорошо работает такой компромиссный вариант, когда клетки сначала инкубируются при мягком перемешивании в 50% ПЭГ в течение 1 мин, затем процент ПЭГ снижается до 35% медленным добавлением бессывороточной среды, и клетки инкубируются еще 5-7 минут. Затем медленно, но с нарастающим темпом и при аккуратном перемешивании суспензия клеток далее разбавляется средой, потом центрифугируется и высевается на культуральные планшеты.

Точный механизм гибридизации клеток еще недостаточно изучен. Вначале, по-видимому, происходит агглютинация (склеивание) клеток, затем слияние клеточных мембран и, наконец, слияние ядер и перестройки хромосомного материала. Имеются данные, что сливаются, в основном, клетки, находящиеся в стадии интенсивного деления. По этой причине клетки миеломы за 12-24 часа до гибридизации переводят в условия, способствующие максимальной скорости роста клеток (повышение содержания фетальной сыворотки, витаминов и ростовых факторов в культуральной среде). Иммунизация в свою очередь стимулирует рост клонов В-лимфоцитов- продуцентов специфических к антигену антител.

6. Культивирование гибридом in vitro и in vitro

Когда клетки становятся достаточно многочисленными, их переносят в лунки объемом 1—2 мл. Для этого за 2 дня до переноса гибридом в планшеты для культивирования (например, Linbro с 24 лунками) вносят ядросодержащие сингенные клетки селезенки (по 5х105 клеток в лунку). Гибридомы аккуратно суспендируют при помощи движений поршня пипетки и переносят по 100 мкл из каждой исходной лунки в 2 лунки объемом 1 мл. .Начиная с 5-й недели после слияния, трижды производят замену среды (ГТ, а не ГАТ). В дальнейшем можно вести культивацию в обычной культуральной среде.

В лунках объемом 2 мл гибридомы так разрастаются, что их переносят в планшеты с четырьмя лунками по 5 мл. Стабильные гибридомы можно переносить в культуральные сосуды по 25—50 мл. На этой стадии можно заменять сыворотку плода коровы нормальной сывороткой коров или лошадей. В этих сосудах среду следует также менять каждые 3—4 дня. На этом этапе можно получить достаточное количество клеток для культивирования in vivo на сингенных мышах.

Отбираемые при смене среды моноклональные антитела можно использовать для характеристики специфичности и молекулярных особенностей иммуноглобулин. В среднем концентрация моноклональных антител в культуральной среде составляет 10—50 мкг/мл.

Культивирование гибридом in vivo

Сингенным мышам предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл полужидкого парафина (DAB 7, VEB Leunawerke, Merseburg) или пристана (Koch-Light Lobs). Через 1—4 недели после предварительной обработки внутрибрюшинно вводят по 2х107 гибридных клеток каждому животному. В асцитической жидкости мышей концентрация моноклональных антител может достигать 5—10 мг/мл. Содержащиеся в асцитической жидкости гибридомы можно перевивать другим мышам после предварительной обработки