Сиволоб. Молекулярна біологія

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

Метилювання ДНК

Субстратом метилювання ДНК є цитозини (метильна група приєднується до п'ятого атому кільця з утворенням 5mC – 5-метилцитозину) у складі динуклеотидів CpG (рис. 6.27). Узагалі, у 70–80 % динуклеотидних контактів CpG обидва цитозини є метильованими в еукаріотичному геномі. Зони, де підтримується деметильований стан CpG (CpG-острівці, див. розділ 4), часто розташовані в промоторах генів домашнього господарства – таких, що є активними незалежно від спеціалізації клітин.

Патерн тканиноспецифічного метилювання ДНК є результатом двох процесів: підтримання метильованого статусу після реплікації та метилювання de novo.

Підтримуюча ДНК-метилтрансфераза (DNA methyltransferase, Dnmt) спрацьовує протягом 1–2 хвилини після реплікації: дві дочірні молекули ДНК містять батьківській ланцюг ДНК (з 5mС у складі CpG) і синтезований ланцюг, де С не є метильованим. Dnmt упізнає такі напівметильовані динуклеотидні контакти й відновлює симетрію щодо метилювання С. За рахунок цього процесу патерн метилювання відтворюється в дочірніх клітинах, що є, поряд з відновленням модифікацій гістонів, одним із важливих механізмів епігенетичного спадкування.

Рис. 6.27. Динуклеотид CpG у ДНК – субстрат метилювання

Інші ДНК-метилтрансферази здійснюють метилювання ДНК de novo. Особливо важливим цей процес є на ранніх стадіях ембріонального розвитку, коли ДНК є тотально деметильованою. У процесі диференціації здійснюється масове метилювання ДНК, що визначає специфічне вимикання певних груп генів у спеціалізованих клітинах. Крім того, деметилювання є можливим і в диференційованих клітинах, де Dnmt використовуються для відновлення метильованого статусу.

Отже, метилювання ДНК є ознакою репресованих і гетерохроматинових ділянок. Залучення 5mС до репресії пов'язане з наявністю у складі певних білків особливих структурних модулів – MBD (Methyl

193

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Binding Domain), які мають специфічну спорідненість до метильованих динуклеотидів CpG. Білки, що містять MBD, є компонентами різноманітних репресуючих комплексів. Зокрема, такі білки рекрутують до метильованих ділянок хроматину гістон-деацетилази. З іншого боку, деацетильований стан гістонових хвостів блокує деметилюючі активності, і навпаки – ацетилювання хвостів може викликати деметилювання ДНК у активних ділянках.

Аналогічно, білки, що містять MBD, рекрутують гістон-метилтранс- феразу, яка здійснює метилювання Lys9 гістону Н3, що призводить до репресії (рис. 6.25, 6.26). І навпаки: Me-Lys9 упізнається білком, що містить хромодомен і рекрутує ДНК-метилтрансферазу.

Хоча Me-Lys9 та 5mС є загальними маркерами конститутивно репресованих ділянок хроматину, не завжди репресія та додаткова компактизація залежить від НР1 – реалізуються також інші системи, більшість з яких є ще не достатньо вивченими. Прикладом такої системи є інактивація однієї з Х-хромосом у клітинах самок ссавців. У складі Х-хромосоми, яка буде інактивованою (обирається випадково на ранніх стадіях розвитку), спрацьовує ген Xist, що продукує велику некодуючу молекулу РНК. Ці РНК укривають собою хромосому і взаємодіють з деякими білками, серед яких – варіант гістону Н2А macroH2A. Імовірно, macroH2A рекрутує гістон-метилтрансферазу (здійснюється метилювання Lys9 гістону Н3) і гістон-деацетилазу. Метилювання Lys9, у свою чергу, зумовлює метилювання ДНК (що забезпечує епігенетичну спадковість). Крім того, до Х-хромосоми рекрутуються структурні компактизуючі білки (але не НР1).

РНК-інтерференція

Гетерохроматин утворюється передусім на послідовностях ДНК, що повторюються. Причому має значення не послідовність як така, а саме наявність повторів. Виявляється, що у формуванні та підтриманні гетерохроматинового стану повторів (принаймні в центромерах) важливу роль відіграє процес так званої РНК-інтерференції

(RNAi – RNA interference).

Узагалі процес РНК-інтерференції запускається будь-якою дволанцюговою РНК (dsRNA – double stranded RNA). Дволанцюгова РНК стає субстратом для РНКази, яка отримала назву дайсер (Dicer) (рис. 6.28): дайсер розрізає молекулу на дволанцюгові фрагменти довжиною 19–21 пари основ (по два нуклеотиди залишаються неспареними на кінцях). Ці фрагменти позначають як siRNA (short interfering RNA),

194

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

вони можуть бути ампліфіковані РНК-залежною РНК-полімеразою

(RdRP – RNA depended RNA Polymerase). Вони зв'язуються з кількома білками, утворюючи комплекс RISC (RNA Induced Silencing Complex).

Один із білків має РНК-геліказну активність і розводить два ланцюги siRNA. Один із ланцюгів здійснює комплементарне спарювання з ділянкою мРНК, що синтезується у процесі транскрипції (вихідна dsRNA має збігатися за послідовністю з кодуючою частиною даного гена), спрямовуючи туди RISC. Один із компонентів комплексу – РНКаза Slicer – здійснює деградацію транскрипту. Крім того, RISC може індукувати активність RdRP для синтезу комплементарного ланцюга РНК на мРНК (чи її частині) як матриці. Відновлена дволанцюгова РНК буде знов підтримувати інактивацію гена шляхом інтерференції. Отже, хоча транскрипція відбувається, реалізується посттран-

скрипційне вимкнення гена (PTGS – posttranscriptional gene silencing).

mRNA

RdRP

dsRNA

Dicer

siRNA

RISC RdRP

Рис. 6.28. Посттранскрипційне вимикання гена завдяки РНК-інтерференції

РНК-інтерференція широко використовується останнім часом як дослідницький інструмент (за схемою на рис. 6.28): достатньо ввести в клітину синтетичну дволанцюгову РНК, послідовність якої ідентична послідовності певного гена, щоб запустити процес інтерференції, вимкнути ген і, таким чином, з'ясувати його функцію. Процес РНК-інтерференції розглядається також як перспективний метод лікування певних хвороб.

195

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

У клітині РНК-інтерференція є однією із систем негативної регуляції експресії генів через використання так званих мікро-РНК (miRNA). Активація генів мікро-РНК (у геномі людини такі гени, які транскрибуються РНК-полімеразою ІІ, присутні в досить великій кількості, яку остаточно не встановлено) призводить до синтезу молекул РНК, що містять дволанцюгові шпильки. Ці шпильки (довжиною 25–35 пар основ) вирізаються нуклеазою і стають субстратом для дайсера. Результуюча дволанцюгова мікро-РНК є аналогом siRNA: один з її ланцюгів є комплементарним ділянці мРНК певного білкового гена, молекула мікро-РНК зв'язується з білками RISC і спрямовує їх до мРНК-мішені. Результатом взаємодії з мРНК може бути її посттранскрипційна деградація (більш характерно для рослин), зупинка білкового синтезу (що є більш характерним для тварин – у цьому разі взаємодія з мРНК відбувається в цитоплазмі), а також рекрутування до хроматину гіс- тон-метилтрансфераз із наступною репресією даного гена. Дещо подібне відбувається і в гетерохроматині.

HMT

Повтори ДНК

RISC

dsRNA

Рис. 6.29. РНК-інтерференція як механізм підтримання гетерохроматинового стану послідовностей ДНК, що повторюються

Участь РНК-інтерференції в підтриманні герехроматинового стану центромер ілюструє рис. 6.29. При порушенні компактизації на центромерних повторах може відбуватися спонтанна транскрипція в різних напрямках. Оскільки матрицею є повтори, існує висока ймовірність синтезу комплементарних молекул РНК: утвориться дволан-

196

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

цюгова РНК, яка запустить процес інтерференції. Крім деградації транскриптів, інтерференція має інший наслідок: RISC, який опиняється в зоні повторів, рекрутує до хроматину гістонметилтрансферазу, що здійснює метилювання Lys9 гістону Н3. За вже відомою схемою (рис. 6.25, 6.26) відбувається зв'язування НР1 і компактизація гетерохроматину.

КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ

1.Порівняйте структуру РНК-полімерази ІІ з такою бактеріальної полімерази. Що є спільного між ними та чим вони відрізняються?

2.Яку будову й функціональне значення має С-кінцевий домен (CTD) РНК-полімерази ІІ?

3.Яку будову має промотор РНК-полімерази ІІ?

4.Охарактеризуйте базальні фактори транскрипції РНКполімерази ІІ та основні етапи ініціації транскрипції.

5.Яке значення має білок ТВР? Яку роль відіграють фактори TFIIB та TFIIН у ініціації транскрипції РНК-полімеразою ІІ?

6.Що таке медіатор? Яку роль він відіграє?

7.Яку спеціалізацію мають еукаріотичні РНК-полімерази різних типів? Порівняйте системи ініціації транскрипції РНК-полімераз І та ІІІ. Що спільного між ними та системою ініціації РНК-полімерази ІІ?

8.Що таке енхансосома? Поясніть принципи модульності та кооперативності при взаємодії факторів транскрипції з еукаріотичними промоторами?

9.Що таке гормоновий рецептор? Дайте визначення сигнальної трансдукції?

10.Яка посттрансляційна модифікація гістонів позитивно корелює з транскрипційною активністю? У чому полягають механізми такої кореляції?

11.Охарактеризуйте комплекси ремоделювання хроматину? Яким

єголовний результат їхні дії. У чому полягають механізми такої дії?

12.Яку роль відіграють білки HMG в активації транскрипції?

13.За якими механізмами здійснюється елонгація РНК-полімерази через нуклеосоми?

14.Опишіть функціональну роль білка НР1 у підтриманні гетерохроматинового стану центромер.

197

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

15.Яку роль відіграє метилування ДНК у репресії транскрипції? Що називається CpG-острівцями?

16.Що таке РНК-інтерференція? Яку роль вона відіграє в підтриманні гетерохроматинового стану?

17.Дайте визначення мікро-РНК і опишіть їхню роль у регуляції транскрипції?

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Agresti, A., Bianchi, M.E. HMGB proteins and gene expression // Curr. Op. Gen. Dev. – 2003. – Vol. 13. – P. 170–178.

Becker, P.B., Hörz, W. ATP-dependent nucleosome remodeling // Annu. Rev. Biochem. – 2002. – Vol. 71. – P. 247–273.

Bernstein, B.E., Liu, C.L., Humphrey, E.L. et al. Global nucleosome occupancy in yeast // Genome Biol. – 2004. – Vol. 5, № 9. – Р. R62 (http://genomebiology.com/ 2004/5/9/R62).

Boeger, H., Bushnell, D.A., Davis, R. et al. Structural basis of eukaryotic gene transcription // FEBS Letters. – 2005. – Vol. 579. – P. 899–903.

Chromatin structure and gene expression: frontiers in molecular biology

/ed. S. Elgin, J.L. Workman. – Oxford : Oxford University Press, 2002. Chromatin structure and dynamics: state-of-the-art. // New Compre-

hensive Biochemistry / ed. J. Zlatanova, S.H. Leuba. – Amsterdam : Elsevier, 2004. – Vol. 39.

Geiduschek, E.P., Kassavetis, G.A. The RNA polymerase III transcription apparatus // J. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 310. – P. 1–26.

Hahn, S. Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription mashinery // Nature Sruct. Mol. Biol. – 2004. – Vol. 11. – P. 394–403.

Heintzman, N.D., Ren, B. The gateway to transcription: identifying, characterizing and understanding promoters in the eukaryotic genome // Cell. Mol. Life Sci. – 2007. – Vol. 64. – P. 386–400.

Krauss, G. Biochemistry of signal transduction and regulation.

– Weinheim : WILEI-VCH Verlag, 2003.

Längst, G., Becker, P.B. Nucleosome remodeling: one mechanism, many phenomena? // Biochim. Biophys. Acta. – 2004. – Vol. 1677. – P. 58–63.

Maison, C., Almouzni, G. HP1 and the dynamics of heterochromatin maintenance // Nature Rev. – 2004. – Vol. 5. – P. 296–304.

Matzke, M.A., Birchler, J.A. RNAi-mediated pathways in the nucleus // Nature Rev. – 2004. – Vol. 6. – P. 24–35.

198

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression // Cell.

– 2002. – Vol. 108. – P. 439–451.

Russell, J., Zomerdijk, J.C. The RNA polymerase I transcription machinery // Biochem. Soc. Symp. – 2006. – Vol. 73, P. 203–216.

Richards, E.J., Elgin, S.C.R. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects // Cell. – 2002.

– Vol. 108. – P. 489–500.

Sims, R.J., Belotserkovskaya, R., Reinberg, D. Elongation by RNA polymerase II: the short and long of it // Genes Dev. – 2004. – Vol. 18.

– P. 2437–2468.

Simpson, R.T. Nucleosome positioning: occurrence, mechanisms, and functional consequences // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. – 1991. – Vol. 40.

– P. 143–184.

Strahl, D.D., Allis, C.D. The language of covalent histone modifications // Nature. – 2000. – Vol. 403. – Р. 41–45.

Studitsky, V.M., Walter, W., Kireeva, M. et al. Chromatin remodeling by RNA polymerases // Trends Biochem. Sci. – 2004. – Vol. 29. – P. 127–135.

199

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Перша стадія кепування: відщеплення одного фосфату (γ-фосфату) із 5'-кінця, що здійснюється фосфатазою.

Друга стадія: перенесення гуанозинмонофосфату (GMP) з гуанозинтрифосфату (GTP) на два фосфатні залишки, що залишились на 5'-кінці (відповідний фермент – гуанілілтрансфераза). Результатом перенесення є утворення ковалентного зв'язку між 5'-фосфатом GMP та 5'-кінцевим β-фосфатом пре-мРНК, тобто формування нехарактерного для нуклеїнових кислот зв'язку між нуклеотидами.

Третя стадія: метилювання метилтрансферазою кінцевого G з утворенням 7-метилгуаніну (7mG).

Рис. 7.1. Стадії утворення та хімічна структура кепу

Три ферментативні активності, які здійснюють кепування, містяться в трьох (дріжджі) або двох (ссавці) білках. Ці ферменти рекрутуються на CTD і 5'-кінець пре-мРНК після синтезу перших 20–30 нуклеотидів транскрипту (рис. 7.2).

Функціонування CTD як платформи для збирання машинерії процесингу мРНК залежить від патерна фосфорилювання залишків Ser, які входять до складу гептапептиду, що повторюється (розділ 6). Наприкінці ініціації транскрипції за рахунок кіназної активності TFIIH здійснюється масоване фосфорилювання Ser5 у складі повто-

202

Розділ 7. Процесинг еукаріотичних МРНК

рів, що приводить до втрати зв'язку CTD із базальними факторами транскрипції та початку руху полімерази.

Під час руху, що почався, за рахунок спорідненості до фосфорильованого Ser5 із CTD зв'язується білковий фактор DSIF (DRB-Sensi- tivity Inducing Factor, DRB – синтетичний інгібітор транскрипції, що спрацьовує тільки за наявності фактора), який рекрутує NELF (Negative ELongation Factor). Цей останній складається з п'яти субодиниць, взаємодіє з DSIF, РНК і РНК-полімеразою, зумовлюючи зупинку руху полімерази.

P

Рис. 7.2. Механізм утворення кепу в координації з транскрипцією

Під час цієї паузи (перший “кадр” на рис. 7.2) із CTD, РНК і DSIF зв'язуються ферменти кепування. Вони спрацьовують і рекрутують

P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b) – гетеродимер, одна із субодиниць якого має кіназну активність: відбувається фосфорилювання Ser2 у складі CTD, а також фосфорилювання DSIF, що приводить до втрати спорідненості DSIF і, відповідно, дисоціації NELF. РНК-полімераза продовжує рух, а сформований кеп відразу зв'язується з двома білками, що формують СВС (Cap Binding Complex). Білки СВС залишаються на кепі до моменту транспорту мРНК до цитоплазми, де замінюються на цитоплазматичні фактори.

203