Сиволоб. Молекулярна біологія

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

Останні два елементи, Inr та DPE, як правило, присутні (якщо присутні) одночасно. Наприклад, приблизно 14 % промоторів дрозофіли містять усі три елементи, 29 % – тільки ТАТА-бокс, 26 % – тільки DPE разом з Inr, 31 % не містять жодного з трьох елементів. У останньому випадку промотор визначається іншими, більш специфічними елементами послідовності. Зокрема, досить часто зустрічається так званий GC-бокс, що розташований, як правило, трохи вище (upstream) відносно положення ТАТА-боксу.

Базальні фактори транскрипції

Послідовність збирання преініціаторного комплексу може бути різною, але всі базальні фактори мають бути присутніми у складі РІС для подальшого запуску транскрипції.

TFIID – один із найважливіших базальних факторів, який визначає впізнання стандартних елементів базального промотора (якщо вони присутні). Основою структури TFIID є ТВР (TATA-box Binding Protein)

– білок зі специфічною спорідненістю до ТАТА-боксу. Досить широкий β-шар у складі ТВР взаємодіє з маленьким жолобком ДНК, наслідком чого є суттєва деформація подвійної спіралі з її розкручуванням та значним вигином у протилежний від білка бік (див. рис. 3.18). Саме з цього протилежного боку (усередині вигину) розташовуються інші білкові компоненти преініціаторного комплексу, які обгортаються промотором (див. нижче). Отже, вигин ДНК, який індукується ТВР, організує промотор і зв'язані з ним елементи в єдиний компактний комплекс і підтримує його стабільність. Досить часто (але не обов'язково) зв'язування TFIID ініціює збирання РІС.

Із ТВР у складі TFIID зв'язані так звані ТВР-асоційовані фактори (TAFs – TBP Associated Factors) – вісім або більше білків (конкретний склад факторів варіює для різних промоторів). TAFs взаємодіють з ТВР і між собою, деякі з них здатні також взаємодіяти з ДНК. Зокрема, TAFІІ150 (або його аналог, 150 – молекулярна вага в кілодальтонах) упізнає DPE (рис. 6.4), тобто забезпечує зв'язування TFIID із базальним промотором, у складі якого відсутній ТАТА-бокс. Якщо у промоторі немає також і DPE, інші TAFs здійснюють білок-білкові взаємодії з факторами транскрипції, що зв'язані з іншими елементами послідовності. Наприклад, GC-бокс упізнається транскрипційним фактором Sp1 (Specificity protein 1), який, у свою чергу, рекрутує TAFІІ110, що стає компонентом TFIID через взаємодію з TAFІІ250 (рис. 6.4).

163

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Рис. 6.4. Взаємодія TFIID з базальним промотором через ТВР (якщо присутній ТАТА-бокс), через один з TAFs (якщо присутній DPE), через інший TAF, що взаємодіє з транскрипційним фактором, зв'язаним із GC-боксом

Білок TAFІІ250 є практично обов'язковим компонентом TFIID (як і ТВР), виконуючи роль основного фактора збирання, з яким взаємодіють інші TAFs. Крім того, TAFІІ250 містить у своєму складі бромодомен і гістон-ацетилтрансферазну активність (розділ 4): відповідно, здатен як впізнавати ацетильовані гістони в зоні промоторів, так і здійснювати таке ацетилювання.

TFIIA – гетеродимерний білок, кофактор, що стабілізує комплекс ТВР з ДНК. Відповідно, цей фактор можна було б вважати ще одним TAF. У системах in vitro TFIIA не є необхідним для ініціації транскрипції, проте його відсутність у клітинах дріжджів є летальною.

TFIIB – мономерний білок із мультидоменною структурою. Два С-кінцеві домени взаємодіють із ДНК по обидва боки від сайта зв'язування ТВР, із внутрішнього боку вигину, який індукується цим білком (рис. 6.5). Таким чином, два білки, які взаємодіють також між собою, зв'язуються з ДНК кооперативно, взаємно підсилюючи спорідненість до неї.

Два С-кінцеві домени TFIIB мають різну структуру і взаємодіють з різними елементами ДНК (маленьким та великим жолобками). Така асиметрія (існування двох альтернативних варіантів зв'язування

зДНК) відіграє роль у визначенні напрямку транскрипції. Це пов’я- зано з тим, що N-кінцева частина TFIIB (практично не має регулярної вторинної структури) взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ. Таким чином, саме TFIIB визначає положення полімерази на ДНК відносно стартової точки в одній із двох можливих орієнтацій ферменту.

Витягнута N-кінцева частина TFIIB взаємодіє з РНК-полімеразою в зоні активного центру, після початку транскрипції здійснює взаємодії

зРНК-ДНК гібридом, а також блокує канал виходу РНК. Тобто TFIIB

164

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

певною мірою виконує функції, аналогічні до функцій бактеріального σ-фактора (розділ 5). Відповідно, TFIIB має бути звільненим при переході від ініціації до елонгації транскрипції (див. нижче).

TBP

TBP

TFIIB

Рис. 6.5. Комплекс із ДНК ДНК-зв'язувального домену ТВР і С-кінцевої частини TFIIB у двох проекціях (1D3U)

TFIIF – гетеродимер, взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ (у зоні активного центру), з ДНК, з базальними факторами TFIIЕ та TFIIН. Після первинного плавлення ДНК при ініціації транскрипції TFIIF здійснює взаємодії з нематричним ланцюгом, стимулює роботу TFIIН (див. нижче), запобігає абортивній ініціації. Після завершення ініціації TFIIF разом з іншими базальними факторами дисоціює від РНК-полімерази, але може реасоціювати з нею під час елонгації – у випадку зупинки ферменту. Його роль як фактора елонгації транскрипції полягає у стимуляції продовження руху полімерази.

TFIIЕ – гетеродимер, стимулює роботу TFIIН, взаємодіє з транскрипційним міхуром при ініціації транскрипції.

TFIIН – найбільший із базальних факторів, складається з 10 субодиниць, має молекулярну вагу, порівняну з такою РНК-полімерази. TFIIН – єдиний базальний фактор, що має ферментативні активності. Перша з них – АТР-залежна ДНК-геліказна (гелікази – helicases – ферменти, що розкручують подвійну спіраль). Частина TFIIН взаємодіє з ДНК нижче від активного центру полімерази (по ходу транскрипції). Імовірно, конформаційні зміни білка, зумовлені гідролізом АТР, викликають обертання подвійної спіралі навкруг своєї осі, а оскільки вище від активного центру ДНК є жорстко зафіксованою, таке обертання призводить до локального плавлення дуплекса в зоні стартової точки. РНК-полімераза ІІ є єдиною з полімераз, яка потребує такої ге-

165

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ліказної активності при ініціації транскрипції, – інші РНК-полімерази, еукаріотичні та бактеріальні, утворюють транскрипційний міхур завдяки певним ДНК-білковим взаємодіям, яким сприяє негативна надспіралізація (див. розділ 5).

Друга ферментативна активність TFIIН – кіназна, за рахунок якої здійснюється фосфорилювання С-кінцевого домену РНК-полімерази при переході від ініціації до елонгації транскрипції. У дефосфорильованій формі (форма А РНК-полімерази), на стадії збирання преініціаторного комплексу, CTD взаємодіє з базальними факторами транскрипції; після фосфорилювання певних залишків Ser (форма О РНК-поліме- рази) ця взаємодія порушується.

Медіатор. Ефективне збирання преініціаторного комплексу є можливою лише за участі ще одного структурного модуля – медіатору (mediator), який містить понад 20 субодиниць (склад варіює для різних промоторів – певний мінімальний набір субодиниць доповнюється більш специфічними за рахунок взаємодії з транскрипційними факторами). Цей мультибілковий комплекс має витягнуту структуру, яку можна розділити на три частини: голова (h, head), середня частина (m, middle) і хвіст (t, tail). Медіатор здійснює лише білок-білкові взаємодії: голова й середня частина взаємодіють з РНК-полімеразою, середня частина та хвіст – зі специфічними факторами транскрипції, що зв'язані на проксимальних і дистальних елементах промотора (рис. 6.6).

166

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

Таким чином, медіатор є засобом передачі “активаційних сигналів” з регуляторних елементів послідовності на РНК-полімеразу: збільшення кількості взаємодій підсилює ефективність збирання РІС.

Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІ

Збирання преініціаторного комплексу є першою подією процесу ініціації. Схему будови комплексу наведено на рис. 6.6: ДНК (базальний промотор) довжиною приблизно 70 пар основ обгортає білкові компоненти РІС. При цьому промоторна ДНК зв'язана головним чином із базальними факторами транскрипції, не з полімеразою: зажим, що формується щелепами полімерази (рис. 6.1) не дозволяє розміститися дволанцюговій ДНК у щілині поблизу від активного центру.

На першому етапі ініціації утворюється закритий преініціаторний комплекс (рис. 6.7).

Рис. 6.7. Процес ініціації транскрипції РНК-полімеразою ІІ

Наступна подія – утворення відкритого комплексу – локальне плавлення ДНК за рахунок геліказної активності TFIIH. Нематричний ланцюг після цього захоплюється фактором TFIIF, матричний – занурю-

167

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ється в активний центр, де взаємодіє також із N-кінцевою частиною TFIIВ. Починається синтез короткого первинного транскрипту, коротка гібридна подвійна спіраль стабілізується тим самим N-кінцевим доменом TFIIВ, який при цьому блокує канал виходу РНК.

На наступному кроці спрацьовує кіназна активність TFIIH: відбувається фосфорилювання, яке є точкою перемикання ініціації на елонгацію. CTD втрачає зв'язок із базальними факторами транскрипції, які дисоціюють від полімерази – відбувається очищення промотора. РНК-полімераза продовжує синтез РНК, а частина базальних факторів може залишатися на базальному промоторі й ініціювати зв'язування іншої полімерази.

Після термінації транскрипції (розділ 7) РНК-полімераза зв'язується з TFIIF, який рекрутує специфічну фосфатазу – відбувається дефосфорилювання CTD, і полімераза вступає в новий робочий цикл.

РНК-полімерази І і ІІІ

Ініціація транскрипції генів рибосомної РНК

Система ініціації транскрипції РНК-полімеразою І виглядає значно простіше. Промотор кожного кластера генів рибосомної РНК (рис. 6.8, див. також рис. 4.6) містить два елементи послідовності: кор-елемент у зоні стартової точки та UCE (Upstream Control Element) на відстані приблизно 100 пар основ від старту. Ініціація залежить від двох транскрипційних факторів: UBF (Upstream Binding Factor) і SL1,

останній позначають іноді як TFIB.

Зв'язування UBF є передумовою ініціації, але цей фактор не має високої специфічності щодо елементів промотора: він зв'язується будь-де в межах рибосомного кластера. Димери UBF містять у своїй структурі HMG-бокси (див. рис. 3.17), які сприяють вигинам ДНК. У результаті зростає імовірність наближення у просторі двох елементів промотора, з якими специфічно взаємодіє SL1. Цей фактор є аналогом фактора TFIID РНК-полімерази ІІ: він містить ТВР і певний специфічний набір асоційованих з ним факторів, від яких і залежить спорідненість SL1 до промотора рибосомного кластера. SL1 рекрутує до промотора РНКполімеразу І, яка починає синтез попередника рРНК.

Отже, для РНК-полімерази І виконується та сама закономірність, що й для РНК-полімерази ІІ: незалежно від присутності чи відсутності ТАТА-боксу (який відсутній у промоторі RNAPI), ТВР має бути обов'яз-

168

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

ковим компонентом преініціаторного комплексу, сприяючи організації промоторної ДНК навкруг полімерази. Ця закономірність зберігається також і для РНК-полімерази ІІІ.

+1

–100

RNAP I

UBF

Рис. 6.8. Ініціація транскрипції РНК-полімеразою І

Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІІ

Промотори генів тРНК і 5S рРНК, які транскрибуються РНК-полі- меразою ІІІ, знаходяться всередині кодуючої частини гена (рис. 6.9). Два елементи промотора гена тРНК, так звані бокси А і В, упізнаються фактором TFIIIC, який рекрутує TFIIIВ, який, у свою чергу, викликає зв'язування полімерази. Фактор TFIIIВ містить у своєму складі ТВР і кілька специфічних для РНК-полімерази ІІІ TAFs.

Усередині гена 5S рРНК замість боксу В присутній інший елемент – бокс С, що впізнається фактором TFIIIА. Далі цей білок рекрутує TFIIIC і формування преініціаторного комплексу продовжується так само, як і на гені тРНК.

Описані події відбуваються однократно. Коли починається транскрипція, полімераза витісняє TFIIIC (і TFIIIА), що знаходиться попереду від неї. TFIIIВ при цьому залишається на місці, рекрутуючи нову полімеразу для нового раунду транскрипції.

169

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Рис. 6.9. Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІІ.

Механізми активації транскрипції

Кілька десятків тисяч еукаріотичних генів (зрозуміло, що йдеться головним чином про білкові гени, які транскрибуються РНК-полі- меразою ІІ) потребують диференційної активації / репресії в певні моменти залежно від типу клітин, стадії розвитку, зовнішніх умов тощо. Як і в прокаріотів (розділ 5), ключовими елементами системи регуляції транскрипції є регуляторні цис-елементи послідовності (проксимальні й дистальні елементи промоторів) і транс-регулятори – білкові транскрипційні фактори (ТФ, під якими будемо розуміти специфічні, не базальні, фактори транскрипції). Проте кількість еукаріотичних генів є значно більшою, і вони не об'єднуються в оперони, коли кілька генів перебували б під контролем одного транскрипційного фактора. Зрозуміло, що кожен ген не може контролюватися своїм особливим фактором транскрипції: фактор також є продуктом певного гена, який також має контролюватися певним фактором.

Другою особливістю еукаріотів є та обставина, що ДНК клітинного ядра організована у складні хроматинові структури (розділ 4), тобто виникає проблема доступності регуляторних елементів послідовності

170

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

(а також базальних промоторів) до транскрипційних факторів, РНК-полімерази та елементів її преініціаторного комплексу. Отже, активація транскрипції потребує перебудов структури хроматину в напрямку деконденсації хроматинової фібрили та визволення цис-елементів від нуклеосом. Для реалізації таких перебудов є два основні інструменти, які діють у тісній координації один з одним: система посттран-

сляційних модифікацій гістонів і АТР-залежні фактори ремоделюван-

ня хроматину, що здійснюють репозиціювання нуклеосом.

Транскрипційні фактори

Відповіддю на необхідність регулювати окремо активність великої кількості генів лімітованим набором факторів транскрипції є принцип модульності будови еукаріотичних промоторів. Цей принцип ілюструє рис. 6.10: три регуляторні (наприклад, проксимальні) елементи послідовності мають спорідненість до трьох транскрипційних факторів, із трьох пар такої взаємодії можна скласти шість комбінацій. Насправді таких пар значно більше, і кількість можливих комбінацій – практично нескінченно велика. Кожен промотор може мати свій власний набір модулів, який відрізняє його від інших промоторів, і, відповідно, власний набір досить великої кількості транскрипційних факторів, потрібних для активації гена.

AD – активаційний

домен ДНК-зв'язуючий домен

Рис. 6.10. Модульний принцип взаємодії транскрипційних факторів із промоторами

Із принципом модульності тісно пов'язаний принцип кооперативності взаємодії транскрипційних факторів із цис-елементами, що знаходяться поряд. Кожен з ТФ зазвичай має порівняно невисоку

171

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

спорідненість до відповідних елементів послідовності. Але якщо два цис-елементи розташовані поруч, і два ТФ здатні взаємодіяти між собою, спорідненість кожного до них підвищується (рис. 6.11): стабільність комплексу значно зростає (експоненціально, див. рівняння (1.6)) завдяки сумі невеликих знижень вільної енергії при взаємодії кожного окремого ТФ. Приклад на рис. 6.11 показує лише один “елементарний акт” кооперативної взаємодії кількох ТФ із промотором.

Рис. 6.11. Приклад кооперативної взаємодії двох транскрипційних факторів із ДНК (1A02)

Крім того, більшість факторів транскрипції мають у своїй структурі принаймні два домени: той, що взаємодіє з ДНК, і так званий активаційний (AD, Activation Domain), який використовується для взаємодії з іншими білками (рис. 6.10). Активацйні домени зв'язують білкові кофактори (коактиватори), у результаті на дистальних і проксимальних елементах промотора формується складний мультибілковий комплекс – енхансосома (enhanceosome). До складу енхансосом часто входять також гістон-ацетилтрансферази та фактори ремоделювання хроматину (див. нижче).

Різні елементи енхансосоми діють синергічно, підвищуючи загальну стабільність комплексу. З іншого боку, відсутність кількох елементів може зумовити дестабілізацію та розпад енхансосоми, де спорідненість до ДНК кожного окремого елемента є невисокою.

172