8542

71

Рис. 1. Внутреннее строение беззубки Anodonta sp. (вид слева)

1 – пищевод; 2 – передний аддуктор; 3 – ротовое отверстие; 4 – нога; 5 – кишка; 6 – правая мантийная складка; 7 – предсердие; 8 – правая жабра; 9 – правая почка; 10 – задний аддуктор; 11 – вводящий сифон; 12 – анальное отверстие; 13 – выводящий сифон; 14 – клоакальная камера; 15 – прямая кишка; 16 – спинной мантийный канал; 17 – задний ретрактор ноги; 18 – спинное мантийное отверстие; 19 – задняя аорта; 20 – артиовентрикулярный клапан; 21 – желудочек; 22 – полость перикардия; 23 – передняя аорта; 24 – печеночный проток; 25 – пилорическое отверстие желудка; 26

– желудок; 27 – отверстие печеночного протока; 28 – печень.

Определение содержания МТ методом радиоактивных индикаторов проводят по методике D. L. Eaton и М. G. Cherian с модификацией Б.И. Сынзыныса. Количество (М) МТ (мкг/г) определяют по формуле:

(1)

где К- кратность разбавления образца; 17,8 - коэффициент; т - масса навески органа или ткани, г; А, К, С- количество распадов в пробе, контроле и стандарте соответственно.

Если содержание МТ в тканях равно 2-3 мкг/г ткани моллюска, это свидетельствует о чистой воде на данном участке водоема.

73

9.Для каждой серии измерений провести анализ "контрольной" пробы (вместо исследуемой на МТ пробы вносят буфер) и общей активности (вместо исследуемой пробы и гемоглобина вносят буфер).

10.Рассчитать количество МТ в каждой пробе по формуле (1).

11.Сделать вывод о влиянии солей Cd в концентрации 0,2 мг/л на

количество МТ в мягких тканях моллюсков по сравнению с контрольным уровнем.

Лабораторная работа №14

ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ОПАСНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПО ИХ СПОСОБНОСТИ СНИЖАТЬ

ФИЛЬТРАЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ГИДРОБИОНТОВ.

74

В формировании качества воды, ее очищении в водных экосистемах участвуют многие физические, химические и биологические процессы. Среди примеров как наиболее важные можно привести процессы окисления органического вещества и фильтрацию воды гидробионтами.

Анализ фильтрационной активности некоторых групп гидробионтов (асцидий, усоногих раков, мшанок, иглокожих, двустворчатых моллюсков, полихет, губок) показывает, что скорость фильтрации обычно составляет от 1 ло 8,8 л в час в расчете на 1 г обеззоленной сухой массы тела. Более детальный анализ зависимости скорости фильтрации от массы гидробионта показал, что она имеет вид степенной функции. Суммарная фильтрация воды популяциями макробеспозвоночных (моллюсков, асцидий, полихет) оценивается величинами 1 – 10 м3 на 1 м2 дна водной экосистемы за сутки.

Данная работа содержит изложение новой методики биотестирования на гидробионтах - фильтраторах - двустворчатых моллюсках.

Принцип метода заключается в том, что моллюски в процессе фильтрации извлекают из воды одноклеточные организмы, что ведет к снижению оптической плотности (OD) воды в сосуде с моллюсками. Регистрация изменений оптической плотности позволяет характеризовать скорость фильтрационной активности и возможное торможение ее при воздействии изучаемого вещества, которое добавляют в воду.

Оборудование и материалы:

моллюски; спектрофотометр (счетчик Култера); весы; термометр для воды; шесть сосудов на 500 мл; сосуды для отстаивания воды; суспензия клеток одноклеточных организмов (одноклеточные водоросли, цианобактерии, дрожжи); исследуемое вещество.

Порядок выполнения лабораторной работы

1. В сосуды 1 – 5 внести одинаковое количество моллюсков.

76

где Аi - оптическая плотность в сосудах с исследуемым веществом в определенной концентрации; Aj — оптическая плотность в сосуде с моллюсками без исследуемого вещества.

Поскольку обычно исследуется вещество, способное ингибировать фильтрацию, в сосудах с исследуемым веществом оптическая плотность выше и ВЭИ больше 100%. Результаты занести в таблицу.

Оценка потенциальной опасности химического вещества по его способности снижать фильтрационную активность гидробионтов

8. Сделать выводы о токсичности исследуемого вещества.

Внимание! При отсутствии спектрофотометра можно использовать ФЭК или счетчик Култера. Вместо регистрации оптической плотности

Лабораторная работа № 15

77

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ВОДЫ ПО ФИЛЬТРАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ДАФНИЙ, РЕГИСТРИРУЕМОЙ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Дафниевый тест, основанный на оценке выживаемости, плодовитости и качества потомства в исследуемых пробах воды, относится к числу основных при нормировании качества природных и сточных вод во многих странах мира. Одной из первичных реакций дафний на действие токсикантов является уменьшение активности их питания, происходящее задолго до возможной гибели рачков. Высокочувствительным является метод слежения за изменением флуоресценции хлорофилла микроводорослей, которыми питаются дафнии. Это позволяет по выходу постоянной флуоресценции (Fo) в течение 1 – 2 мин определить концентрацию водорослей в пробе в диапазоне от 1 тыс кл./мл до 5 млн кл./мл по калибровочной кривой.

В настоящее время для этих целей используют флуориметры, {разработанные в России (в частности, на кафедре биофизики биологического факультета МГУ), а также зарубежными фирмами (в частности, ТоксиРАМ фирмы Walz GmbH, Германия).

Предлагаемая методика основана на использовании скорости фильтрации пищи (микроводорослей) дафниями, рассчитываемой по уменьшению флуоресценции водорослей в пробе в процессе выедания их рачками; методика удобна для быстрой предварительной оценки токсичности воды.

Оборудование, материалы, объекты:

флуориметр, стеклянные стаканчики объемом 50 мл, используемые в качестве садков для дафний; автоматическая пипетка на 1 мл с расширенным носиком для отлова дафнии, вода из природного источника; лабораторные культуры ветвистоусых рачков-фильтраторов Daphnia magna, выращиваемых по методике, приведенной в лабораторной работе № 8 методических указаниях "Экологическая диагностика факторов окружающей среды с помощью

78

животных".Кормом для дафний служит отмытая от среды и сконцентрированная культура зеленой водоросли Chlorella vulgaris, выращиваемая по методике, приведенной в лабораторной работе № 8 методических указаниях "Экологическая диагностика факторов окружающей среды с помощью животных".

Порядок выполнения лабораторной работы

1.В стеклянные стаканчики-садки налить по 50 мл исследуемой пробы воды из природного источника, а также воду, используемую для культивирования рачков (контрольная проба). Все в трех повторностях.

2.В каждый стаканчик отсадить по 5 дафний 6 — 8- дневного возраста (длиной примерно 3 — 4 мм), осторожно отобранных автоматической пипеткой (либо стеклянной пипеткой) из культуры.

Примечание. При хорошем навыке в пробу попадает не более 1 – 1,5 мл среды культивирования дафний.

3.Оставить дафний в садках на сутки. Корма не добавлять. Суточное голодание приводит, с одной стороны, к увеличению скорости фильтрации, с другой — к уменьшению разброса получаемых результатов.

4.После суточного выдерживания из садка осторожно отлить воду (объем воды в садках должен составить 25 мл).

5.Отобрать пробу воды (3 мл) в кварцевую кювету и измерить

фоновую флуоресценцию (Iф) на флуориметре. Результаты занести в таблицу.

Оценка токсичности природной воды по фильтрационной активности

79

Daphnia magna

6.Добавить в садок суспензию водорослей до плотности около 100 тыс. кл./мл, осторожно взболтать садок для равномерного распределения водорослей по объему.

7.Отобрать из садка пробу (3 мл) и измерить флуоресценцию в

начальный момент времени (Io). Отобранную пробу вновь вернуть в садок.

8.Аналогичные операции провести с остальными садками, содержащими дафний.

9.Кроме контроля с дафниями следует поставить контрольный стаканчик с исследуемой жидкостью, но без дафний — для оценки собственных изменений флуоресценции водорослей и внесения при расчетах соответствующих поправок.

Примечание. Для сведения этих изменений до минимума садки во время эксперимента должны быть помещены в затемненное место.

10. Через 30 мин после внесения корма садки можно повторно взболтать.