8542

11

2.Настройте микроскоп для работы с препаратами на малом увеличение.

3.Рассмотрите постоянные и временные препараты меристемы корешка. При обнаружении контуров клеток, микроскоп приведите с малого на большое увеличение.

4.Произведите подсчет клеток каждой стадии митотического цикла /интерфазы, профазы, метафазы, анафазы, телофазы/ в нескольких полях зрения.

5.Данные по подсчету занести в таблицу, просуммировать по всем стадиям количество клеток.

6.Определение митотический индекс на основе данных таблицы. Подумайте, о чём говорит полученный митотический индекс? Можно ли использовать эту ткань для приготовления препората, является ли она меристемой?

7.Определите относительную длительность фаз митоза. Сравните, сколько клеток находится в интерфазе, профазе, метафазе, анафазе, телофазе.

8.Сравните временные и постоянные препараты.

9.Сделайте выводы о митотической активности исследуемой ткани.

Лабораторная работа №2

Подготовка материалов для цитогенетических исследований

Тема: методы подготовки материала для цитогенетических исследований.

Цель: изучить методы приготовления материала для цитогенетических исследований.

Приборы и материалы: чашки Петри или часовые стекла, фильтровальная бумага, резиновая груша» пробирки, резиновые пробки, с вставленными пипетками, водяная баня, химические агенты (колхицин, А- бромнафтапин, пара-дихлорбензол или 8-оксихинолнн), ядерные фиксаторы, ацетокармин, растительный материал.

Теоретическая часть.

12

Успех цитологического исследования зависит не только от качества фиксации , окраски препарата и т.д. Решающее значение имеет состояние материала, взятого

для исследования. Выбор материала прежде всего зависит от задач исследования : изучается ли деление клеток или хромосомный набор, или микро-, макроспорогенез и т.д. Независимо от этого существуют общие правила для любой фиксации. Материал должен быть здоровым, свежим, находиться в хорошем состоянии. Растению должны предоставляться оптимальные условия развития. Для изучения митозов в клетках растений чаще всего семена проращивают в чашках Петри на нескольких слоях влажной фильтровальной бумаги. Проращивание проводится в термостате при Т=24-25 ° С в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге, свернутой в рулон. Берется полоска фильтровальной бумаги 15x30 мм, вдоль длиной стороны бумаги, ближе к одному из них раскладываются семена, так чтобы корешки росли внутрь полосы. Полоска свертывается в рулон и опускается в стакан, на дно которого налита вода .Стакан ставят в термостат .’ Лучше всего семена проращивать на песке или & горшочках с рыхлой землей . На фильтровальной бумаге корешки получаются более тонкие , кривые , митозы в них скучены.

Для изучения мейоза , микроили макроспорогенеза бутоны разного размера лучше брать в середине цветения данного растения.

I Переработка растительного материала. Для проведения ариотипирования или подсчета числа хромосом часто проводится потенциальная предфиксационная обработка материала.

Для этого используют различные химические агенты или действуют элодом. Из химических агентов применяют колхицин. А- бром-нафталин , ара-дихлорбензол, 8-оксихинолин и др. Колхицин применяется в виде ,01-0,05% раствора. Мелкосеменные формы обрабатывают 0,01% аствором колхицина в течение 3-4 часов. /

Для обработки корешков пара-дихлорбензолом и 8-оксихинолином используют насыщенные растворы этих веществ. Насыщенный раствор ара-дихлорбензола (5-10 г кристаллического вещества на 500 мл истиллированной воды) может храниться неограниченно долго, насыщенный раствор 8-оксихинолна должен быть свежеприготовленным, часто используется 0,002М раствор 8- оксихинолина(0,058г 8- ксихинолинана 200 мл теплой дистиллированной воды), в котором обрабатывают корешки 3-4 часа при Т==10-14° С также, как и в парадихлорбензоле. Иногда обработку

13

8-оксихинолином проводят в холодильнике при Т“0-4° С, оставляя там материал на 12-14 часов.

Обработку пара-дихлорбензолом и 8-оксихинолином лучше совместить обработкой колхицином . Вначале корешки обрабатывают раствором ,05% колхицина в течении двух часов в термостате (+24° С)' или при комнатной температуре ,а затем выдерживают в насыщенном растворе 8- ксихинола два часа при Т~8-10° С.

Моно-бромнафталйн-а рекомендуютдля проведения ариотипирования. Используют насыщенный раствор . Для

приготовления насыщенного раствора 3-4 капли монобром нафталина разбрызгивают резиновой грушей в 100 мл дистиллированной воды . Смесь взбалтывают. В такую смесь опускают корешки 0,8-1,5 см дойной н обрабатывают их в течение 8-10 часов при Т= 1-2^2 периодически взбалтывают смесь. При Т = ~KfC время обработки уменьшают до 5 часов.

При такой предобработке хромосомы расплавляются, укорачиваясь

вфазной степени. В клетках меристемы происходит накопление К- митозов . Предобработка обычно проводится в малых чашках Петри или в часовых теклах . В реактив погружаются или отрезанные корешки крупносеменных юрм или пророщенные мелкие семена.

1ри учете перестроек хромосом для изучения первых митозов мелкие семена проращивают до размера корешков в 1-3 мм, крупные семена - до ,5-2 см. Так, семена скерды (Crepis Capillaris) проращивают до длины орешков 2-3 мм, продолжительность проращивания обычно 36 часов.

Йемена луков (Allium сера, Ailum fistulosum) проращивают 55-64

часа дина корешков 4-5 мм. Продолжительность проращивания бобов - Vicia dba - при предварительном намачивании в течении двух часов , примерно

80 часов .Первые митозы наблюдаются в корешках длиной 1,5-2 см

. Пшеницу проращивают 40-42 часа, предварительно зерна намачивают

вдистиллированной воде в течении 2-3 часов. Оптимальная длина корешков 0,8 - 1,2 см.

Время во всех случаях дано при проращивании семян в термостате при 24° С. После обработки колхицином или другим веществом корешки промывают в воде 10-20 минут и затем фиксируют.

Фиксация материала. клеток путем превращения клеточных коллоидов в наиболее стойкие неэластичные нерастворимые гели , при этом сохраняется прижизненная структура структура всех компонентов клетки. Для цитологических исследований хромосомного материала

14

обычно используют ядерные фиксаторы коагулирующие нуклеопротеиды хромосом . Наиболее распространенными ядерными фиксаторами, используемыми в кариологических исследованиях, являются уксусная кислота ,хромовая кислота , хлороформ , формалин, осмиевая кислота, этиловый спирт . Обычно фиксатор представляет собой смесь нескольких компонентов, каждый из которых обладает специфическим действием.

Нуклеопротеиды. Вызывает набухание цитоплазмы и не уплотняет ее при дальнейшей обработке, что усиливает контраст между ядром и Цитоплазмой. При добавлении спирта к уксусной кислоте происходит фиксация и уплотнение нехромосомных белков . После фиксации с уксусной кислотой хромосомы хорошо красятся основными красителями.

Этиловый спирт. Хорошо осаждает нуклеиновые кислоты, альбулины, глобулины, но растворяет липоиды. Один этанол редко используется в качестве фиксатора., т.к. вызывает в результате обезвоживания сильное сжатие ткани, сморщивание и уплотнение, искажение внутриклеточных * структур.

Фиксатор Кларка (уксусный алкоголь^спирт-Ьуксусная смесь).

3 части 96% спирта; 1 часть ледяной уксусной кислоты . Продолжительность фиксации около 4 часов. При желании материал можно оставить в фиксаторе в холодильнике на ночь. В нем также можно хранить материал при температуре 0-3 ° С. Однако при окрашивании по Фельгену длительное хранение в фиксаторе не рекомендуется. В спиртовых фиксаторах уксусную кислоту иногда заменяют на пропионовую, т.к. со временем в них происходит деполимеризация и экстрагирование ДНК, что существенно сказывается Щ1 интенсивности окрашивания.

100 мл 96° спирта, 100 мл пропионовой кислоты , 0,4 г гидрата окиси железа или 3 части 96° спирта ,1 часть пропионовой кислоты.

Перед тем как поместить объект в этот фиксатор , на каждые 100 мл смеси добавить несколько капель кормина, пока фиксатор не окрасится в бледно-розовый цвет.

В фиксатор Кларка можно также добавить следы хлорида железа сколько капель концентрированного водного раствора ), пока фиксатор красится в бледно-соломенный цвет. При этом методе цитоплазма делается мягкой и пластичной и поэтому облегчает распластывание клеток . Резные квасцы можно использовать и для протравливания после квасции путем помещения материала в 4% водный раствор квасцов на 20мин. перед окрашиванием. При хранении в 70° спирте в

15

холодильнике :ле двух месяцев качество фиксации и окраски

2.Объем фиксирующей жидкости должен в 10-20 раз превосходить путем фиксируемого материала.

3.Фиксатор должен быстро и равномерно проникать в ткань . Для этого берут объем фиксируемой ткани . Толстые корешки расщепляют с резаной стороны . Кончики корней отрезают длиной 6-7 мм , бутоны 1ычно фиксируют целиком , колосья предварительно разбивают на шоски.

4.Объект не должен плавать на поверхности, что наблюдается при скружении объекта пузырьками воздуха . Воздух удаляют продолжительным встряхиванием пробирки с фиксатором и объектом, проросшие мелкие семена фиксируют целиком.

5.Пробирки с фиксатором не рекомендуется оставлять на

свету.

6.Время фиксации должно быть оптимальным. При окрашивании летокармином или ацетоорсеином удовлетворительное окрашивание случается даже после хранения в фиксаторе в холодильнике в течении ескольких лет. После фиксации материал промывается 96° спиртом и ранится в холодильнике в 70° спирте.

3.Окрашивание ацетокармином. Ацетокармин используется для подкрашивания корней, молодых листьев, бутонов , семенников, нервных англиев, слюнных желез.

При работе с растениями корешки или прорастающие семена из фиксатора (3:1) или 70° спирта помещают в небольшую пробирку высотой >-10 см с ацетокарнином, налитом в таком количестве , чтобы полностью закрыть корешки . Пробирку закрывают резиновой пробкой ,в которую доставлена длинная трубка (пипетка) , и грающая роль обратного холодильника (в противном случае уксусная кислота при нагревании будет быстро улетучиваться, что снизит проникающую способность фасителя, следовательно, интенсивность окрашивания).

Пробирку помещают в кипящую баню на 10 минут (следить ,чтобы вровень воды в бане был ниже краев пробирки ). В качестве бани можно использовать химический стакан, на дно которого помещают слой ваты или фильтровальной бумаги.

В процессе нагревания в ацетокармине происходит не только окрашивание, но и мацерация материала. Длительное нагревание может

16

вызвать разбухание и фрагментацию хромосом. Поэтому мелкие корешки мацерируют 6-8 минут, крупные - около 10 минут.

Оставляют пробирку на 10 минут до полного охлаждения и окрашивания объекта. Для получения удачной окраски кармином большое значение имеет его качество.

Проба на качество: немного кармина помещают в пробирку и заливают 96° спиртом, он не должен растворяться даже при нагревании. Следы кислоты, оставшейся на препарате из-за недостаточной промывки , могут уже в течении короткого срока уничтожить на препарате окраску чувствительных к кислоте красителей. Очень вредны также следы кислот , которые могут остаться после мытья уже употреблявшихся предметных стекол.

Ход работы:

1 г кармина растворяют в 100 мл 45% уксусной кислоты и кипятят в течении часа. После кипячения встряхивают и фильтруют , предварительно дав раствору остыть . Кипячение проводят под тягой а колбе с обратным холодильником ,т.к. улетучивание уксусной кислоты снижает проникающую способность красителя( при необходимости можно использовать краситель более высокой 2 - 4% концентрации). * j

Для получения более темного спектра окрашивания в краситель можно добавить 1-2 капли 45% уксусной кислоты , насыщенной уксусным железом. Избыток железа осаждается кармином. Часто в практике эту процедуру заменяют помещением в свежеприготовленный краситель на несколько часов железной скрепки или кнопки, затем раствор отфильтровывают. Остатки кармина на фильтре можно использовать повторно.

Лабораторная работа №3

Приготовление препаратов

Разработка метода давленных препаратов существенно обогатила цитогенетические исследования в области кариологии, т.к. позволила изучать целые не перерезанные хромосомы, расположенные в одной плоскости.

Цель: приготовление препаратов из корешков растений (или пророщенных зёрен).

17

Задача: освоить правила приготовления давленных препаратов из корешков растений (или пророщенных зерен).

1.Корешки лука с зоной деления (иди пророщенные зерна); 2.Предметные стекла с лункой (иди небольшое часовое стекло); 3.Предметные и покровные стекла; 4.Лезвие бритвы, 5.Препаровольные иглы; 6.Пипетка;

7.Пробирки с обратным холодильником;

8.Фильтровальная бумага;

9.Микроскоп;

10.Рисовальный аппарат,

11.Стеклянная или резиновая скобка; 12.Стаканчик;

13.Металлический стержень (d = 1,5—2 см) с приваренной платформой. Переносят на середину предметного стекла в кашпо 45% уксусной кислоты, затем объект закрывают покровным стеклом. Надавливая препаровальной иглой ва покровное стекло, слегка расплющить кусочек ткани. А затем легким постукиванием по покровному стеклу добиться расхождения клеток. Это состояние соответствует образованию слабо розового пятна на месте объекта.

14.Полученный препарат исследовать под микроскопом.

Приготовления постоянных препаратов Для приготовления постоянных препаратов необходимо временные

давленные препараты подвергнуть обезвоживанию для заключения в бальзам или другую среду, при этом важно не нарушить монослой клеток, полученный на временных давленных препаратах. Для стабилизации монослоя на стекле при перевода временных препаратов в постоянны, используют сухой лед, жидкий азот и яйчный альбумин.

Перевод временных_щрепаратов в постоянные с помощью сухого льда. Если сразу ставить цель перевода временных препаратов в постоянные, то нет необходимости окантовывать временные препараты. В том случае, когда решение принимается после анализа препарата, окантовочные следы удаляются. Сухой лед из сосуда Дюара или широкогорлого термоса, где он должен постоянно храниться, обкатывают на стеклянной поверхности для получения ровной площадки и помещают в деревянную или картонную коробку гладкой стороной вверх. Предметные стекла укладывают на лед, объектом наружу и выдерживают для примораживания около 3 минут, более

18

продолжительное выдерживание не страшно. Для лучшего контакта предметного стекла со льдом его можно придавить грузом. В процессе примораживания на препарат не следует дышать, иначе теплые пары воздуха образуют иней на стекле, что затруднит снятие покровного стекла. .Затем покровное стекло поддеть под уголок бритвой и быстрым движением откинуть его (в это время препарат удобнее держать в руке). Быстро, чтобы не дать объекту опаять, сложить препараты по два объектами наружу и провести по гистологической батарее начиная с

сдвинуть объект. Резиновый наездник можно сделать из половинок разрезанного на кусочки узкого шланга.

Перевод временных давленных препаратов в постоянные с помощью жидкого азота. Жидкий азот наливают в небольшой сосуд Дюара иди термос с узким горлышком, фарфоровый узкий стакан. Туда опускают металлический стержень диаметром 1,5—2 см, на противоположной стороне которого приварена металлическая платформа размером с предметное стекло или больше и толщиной 1—2 см, чтобы удерживать холод. Для примораживания объекта предметные стекла помещают поперек платформы по 2—4 стекла на 2-3 минуты. Затем сбрасывают покровные стекла и обезвоживают 96° спиртом 2-3 минуты. В летнее время необходимо перед примораживанием саму платформу поместить на некоторое время в жидкий азот. Стержень подобной конструкции удобно вынимать и удерживать в вертикальном положении, вадев на него узкий стеклянный цилиндр на подставке.

Зарисовка препаратов.

Для выполнения рисунка применяют рисовальный аппарат РА-4. Рисовальный аппарат состоит из зеркала, откидной оправы, в которую вмонтирован призма-кубик и два набора светофильтров, и. кольцахомутика. Предварительно в микроскопе наклонный тубус заменяется на вертикальный.

1.Для установки рисовального аппарата из тубуса микроскопа вынимают окуляр и на тубусе при помощи кольца-хомутика закрепляют рисовальный аппарат.

2.Окуляр вставляют на место. Откидная оправа аппарата должна лечь на окуляр. Плоскость откидной оправы и верхней линзы окуляра должны быть параллельны.

3.Зеркало устанавливают под углом 45° к штанге.

19

4.Плоскость рисунка должна быть перпендикулярна оси

тубуса.

5.Чтобы увидеть одновременно изображение объекта, бумагу

иконец карандаша, следует уравнять освещенность этих предметов, пользуясь реостатом осветителя и наборами светофильтров.

6.Наблюдая через призму рисовального аппарата, жестким,

тонко заточенным карандашом на бумаге обводят контуры изображения

структур препарата. У f

7.После проверки контуров откидывают оправу с призмой и,> глядя в окуляр микроскопа, дополнительно вносят мелкие детали в рисунок.

8.Контуры рисунка обводят тушью. Некоторые структуры,; например хромосомы, покрывают тушью, строго сохраняя специфику их Структуры. В местах пересечения хромосом вдоль лежащей сверху хромосомы оставляют белые ободки, которые таким образом пересекают нижележащую хромосому.

9.В качестве масштаба, при той же оптике, на рисунке зарисовывается участок линейки объект-микрометра, помещенного на столик микроскопа. Обычно при работе с объективами 90х и 40х зарисовывают участок пинейки, равный 10 микрон, при малых

увеличениях — 50 микрон.

Лабораторная работа №4

«Микроскопическое изучение кариотипов животных и растительных клеток»

Теоретическая часть:

Для того чтобы освоить методы учета аберраций хромосом, необходимо вначале овладеть техникой микроскопирования и анализа кариотипов растительных и животных организмов.

Установка освещения в микроскопе по методу Келера: 1.Соединить осветитель микроскопа при помощи соединительной

планки с микроскопом и трансформатором и включить свет.

Для центровки света в микроскопе (на малом увеличении):

20

2.Необходимо закрыть диафрагму конденсора и осветителя (конденсор в верхнем положении).. Убрать матовое стекло.

Световой пучок от осветителя направить на плоское зеркало микроскопа и, перемещая патрон осветителя вдоль оси, добиться четкого изображения нити накала в плоскости зеркала (на зеркало положить листок белой бумаги). Убрать бумагу и получить четкое изображение спирали на закрытой диафрагме конденсора (в центре).

3.Открыть диафрагму осветителя и сфокусировать микроскоп на препарат путем перемещения тубуса микроскопа.

4.Закрыть диафрагму осветителя (полевую диафрагму) и, глядя в микроскоп, с помощью зеркала отцентрировать ее изображение

(светлый круг) в поле зрения микроскопа.

5.Добиться резкого изображения краев диафрагмы (светлого круга) перемещением конденсора.

6.Для коррекции диафрагмы осветителя и поля объектива необходимо: глядя в микроскоп, открыть диафрагму осветите-1 1 ля так, чтобы границы освещенного поля за пределы поля зрения микроскопа едва выходили.

7.Для коррекции диафрагмы конденсора и поля объектива необходимо: вынуть окуляр и, глядя в тубус микроскопа, увидеть закрытую диафрагму конденсора в задней линзе объектива. Глядя в тубус микроскопа, открыть диафрагму . конденсора до тех пор, пока ее отверстие не совпадет с ’ границами задней линзы объектива (как только это произойдет — светлой поле перестанет увеличиваться).

фильтр. Для повышения контраста изображения можно диафрагму конденсора закрыть до л2/3 выходного зрачка объектива.

Каждый вид растений и животных имеет свой кариотип, т.е. хромосомный набор клетки, характеризующийся определенным числом хромосом, определенной их морфологией и величиной.

Сопоставление кариотипов ряда видов помогает выяснить степень филогенетического родства видов, характер их эволюционного происхождения. Изучение ,кариотипа также необходимо при работах по утагенезу при анализе структурных перестроек хромосом.

Изучение кариотипа организма является центральным вопросом итогенетичёских исследований.

Каждый организм характеризуется определенным числом хромосом, имеющим в метафазе митоза свою определенную морфологию. 4еристематическая клетка содержит диплоидиый, соматический набор хромосом, зиготический двойной, состоящий из пар гомологических хромосом, происходящих от отца и матери. Этот