Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

НасередовищіВілліса-Хоббса(МПАзлакто- зою, індикатором нейтральним червоним, яєчним жовтком і знежиреним молоком) колонії C. perfringens червоного кольору і зоною опалесценції; колонії C. novyi безбарвні (не розкладають лактози), але із зоною опалесценції; колоніїС. septicum червоні; навколоколонійC. histolyticumєзонапросвітлення.

КолоніїC. histolyiticum, С. sordellii безбарвні,

а ореол опалесценції мають лише колонії C. sordellii. На кров’яному агарі з бензидином колонії C. novyi чорніють після перебування на повітрі.

При посіві матеріалу уколом у стовпчик агару Вільсона-Блера вже через 3-4 години в ділянках росту C. perfringens середовище чорніє. Характерні особливості росту на молоці і середовищі Вільсона-Блера використовують для експресдіагностики газової гангрени, викликаної C. perfringens.

Колонії, що виросли на диференціально-діагностичних середовищах, мікроскопують, пересівають на середовище Кітта-Тароцці, отримують чисту культуру й ідентифікують її за морфологічними, культуральними і біохімічними властивостями. Важливе значення має визначення типів екзотоксинів.

При відсутності анаеростатів та інших приладів для створення анаеробних умов ізольовані колонії, а отже й чисті культури, можна отримати шляхом посіву різних розведень досліджуваного матеріалу у трубки Віньяль-Вейона за методом Вейнберга. Матеріал розводять 1:10, 1:100, 1:1000 у розтопленому і охолодженому до 45 °Сцукровомуагарі, розлитомувпробіркипо10 мл. Ізкожногорозведення агар натягують у трубки, а капілярний кінець запаюють на вогні. Після інкубації при 37 °С трубки розпилюють надфілем, стовпчик агару з характерними колоніями анаеробів виштовхують у стерильну чашку Петрі. Потім колонії петлею пересівають у середовище Кітта-Тароцці, вирощують чисті культури й ідентифікують їх.

У ряді розвинутих країн оранізовані спеціальні лабораторії, в яких використовують сучасні апарати і тест-системи для культивування й ідентифікації анаеробів, а також бокси, де всі посіви, пересіви та інші маніпуляції проводять при повній відсутності кисню повітря.

Однакурутиннихбактеріологічнихлабораторіяхвиділенняіповнуідентифікацію чистих культур проводять рідко, оскільки весь процес займає багато часу, вимагає складних і дорогих живильних середовищ та спеціальних приладів. У зв’язку з цим для більш швидкої діагностики анаеробної газової інфекції і вибору відповідних лікувальних антитоксичних сироваток проводять визначення типів екзотоксинів за допомогою реакції нейтралізації in vivo.

Біологічні дослідження. Для постановки тесту нейтралізації використовують видові діагностичні антитоксичні сироватки, центрифугати (фільтрати) бульйонних культур і білих мишей, масою 16-18 г. У 6 пробірок вносять по 0,9 мл

центрифугату, потім у 5 з них добавляють по 0,6 мл антитоксичних сироваток до основних видів збудників (табл. 55). У 6-у пробірку вносять 0,6 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (контроль). Суміші витримують у термостаті протягом 40 хвікожну знихвоб’ємі0,5 млвводятьвнутрішньовенно двом мишам. Видову належність культури (токсину) визначають за мишами, що вижили, при загибелі тварин контрольної та інших дослідних груп.

Улабораторіях, деєможливостіпрацюватизкультурамитканин, реакціюнейтралізації ставлять на трипсинізованих клітинах 10-12 денних курячих ембріонів.

Токсигенність можна визначити ще на етапі росту ізольованих колоній. Для цього колонію емульгують на склі у краплі акридинового оранжевого, накривають покривним скельцем і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. Наявність тільки зелених паличок свідчить про їх токсигенність. Червоні або зелені з червоними фрагментами бактерії виявляють при слабкій продукції токсинів або при повній їх відсутності.

Можнавстановитивидітиптоксинувреакціїпреципітаціїнаскліуагаровому гелі з фільтратом та відповідними антисироватками в реакції гальмування in vitro специфічними антитілами лецитиназної чи лейкотоксичної активності фільтратів або ранових ексудатів.

Ще швидше і точніше встановлюють види збудників газової гангрени за допомогою газової хроматографії, яка дозволяє визначати їх за якісним і кількісним вмістом насичених і ненасичених жирних кислот.

Діагностику харчових токсикоінфекцій, викликаних C. perfringens типів А і С, проводятьзадопомогоюбактеріологічногодослідженнязметоювиділеннязбудника, визначення масивності контамінації ним харчових продуктів і типу токсинів.

Виділення чистих культур проводять так само, як і при анаеробній газовій інфекції (висів матеріалу на середовища Цейслера, Вілліса-Хобса або в трубки Віньяль-Вейона, отримання ізольованих колоній, чистих культур, ідентифікація).

При цьому обов’язково сіють10 мл крові хворого в 150-200 мл середовища КіттаТароцці з метою виділення C. perfringens. Із фільтратом культури важливо поставити реакцію нейтралізації на мишах для визначення типу екзотоксину.

Важливо провести і кількісний мікробіологічний аналіз. Для цього досліджуваний матеріал розводять у пептонній воді від 10-1 до 10-10 і по 1 мл кожного розведення засівають у розтоплене і охолоджене до 45 °С середовище ВільсонаБлера. Через 6-8 год інкубації при температурі 45-46 °С (або 20 год при 37 °С) відбирають ті проби, в яких виросло 10-30 колоній, і обчислюють кількість бактерій в 1 мл посівного матеріалу, враховуючи ступінь розведення і посівну дозу.

Для швидкого виявленняC. perfringens досліджуваний матеріал сіють у пробірку з лакмусовим молоком. Через 4-5 год відбувається характерне утворення губчастого згустка і просвітлення сироватки.

Діагнозхарчовоїтоксикоінфекції встановлюютьтоді, коливиявляють значне обсіменіння(106 ібільшев1 г) тихпродуктів, щоспричинилизахворювання, виділяють C. pergringens типів А і С і відповідні екзотоксини, або ж висівають з крові хворого C. perfringens будь-якого серотипу ( A, B, C, D, E, F).

Діагностика псевдомембранозногоколіту. C. difficile єчастимнозокоміаль-

нимпатогеном, якийу90-100 % випадківвикликаєцезахворюваннянафонінераціональноїтерапіїантибіотиками(ампіцилін, кліндаміцин, цефалоспорини). Вказані препарати викликають глибокий дисбаланс мікрофлори кишечника і колонізацію слизовоїC. difficile. Бактерії продукують 2 види токсинів– ентеротоксин (токсин А) і цитотоксин (токсин В).

Лабораторний діагноз псевдомембранозного коліту потребує взяття псевдомембранприколоноскопіїівиділеннязбудниказбіоптатівслизовоїоболонкисліпої кишки або випорожнень. C. difficile висівається майже від усіх хворих за допомогою тих же методів, що і при інших анаеробних інфекціях. “Золотим стандартом” є цитотоксичний тест: фільтрат фекалій або культури вносять у флакон з моношаром культури клітин, в результаті цього виникає цитопатична дія, що нейтралізується специфічною антисироваткою. На жаль, він досить громіздкий і забирає багато часу.

Швидка латекс-аглютинація застосовується часто, але вона не є високо-спе- цифічноюічастодаєхибно-позитивнііхибно-негативнірезультати. Більшточним івисокоспецифічнимєімуноферментнийаналіз, якийдаєзмогунадійновиявляти цитотоксин і ентеротоксин C. difficile.

Бактероїдози

Анаеробні інфекції можуть викликати не лише клостридії, а й грамнегативні поліморфніаспорогеннібактеріїзродиниBacteroidaceae. Найчастішегнійно-сеп- тичніпроцесиспричиняютьпредставникиродів:Bacteroides (B. fragilis); Prevotella (P. melaninogenicus та ін.); Fusobacterium (F. nucleatum, F. necrophorum); Veillonella

(V. atipica, V. parvula). Захворювання, що вони викликають, дістали назву бактероїдозів, фузобактеріозів, вейлонельозів. Це можуть бути септицемії, апендици-

254 Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ти, перитоніти, менінгіти, абсцеси, гангрени органів, виразки шкіри, ураження дихальних і сечостатевих шляхів тощо. Часто вони виникають як ускладнення після оперативних втручань на товстому кишечнику, сечових шляхах, матці, в ротовій порожнині.

Діагностика бактероїдозів. Єдиним ефективним методом розпізнавання захворювань, викликаних бактероїдами, є бактеріологічний. Принцип взяття і транспортування досліджуваних матеріалів (кров, ліквор, гній, харкотиння, сеча, кал, шматочки уражених тканин та ін.) такі самі, як і при анаеробній газовій інфекції. Слід уникати контакту проб з атмосферним повітрям. Найбільш оптимальним є взяття аспіратів і доставка їх у шприцах з видаленим повітрям.

Після первинної мікроскопії матеріалу його сіють на спеціальні живильні середовища(кров’яний, сироватковий, тіогліколевийагарздодаваннямекстрактів з мозкової тканини, геміну, вітаміну К). Культивують у строгих анаеробних умовах в атмосфері 10 % CO2 при 37 °С.

У мазках, забарвлених за Грамом, B. fragilis мають вигляд прямих або трохи зігнутих грамнегативних паличок, без спор і капсул, розташованих поодинці, парами або короткими ланцюжками з 3-4 клітин (див. вкл., рис. 18). При забарвленні метиленовим синім часто фарбуються біполярно.

Бактероїди ростуть повільно (5-7 днів). Колонії B. fragilis дрібні (до 1 мм), трохи вгнуті, сірувато-білі, без зон гемолізу. B. melaninogenicus на кров’яних середовищах утворює гладенькі або шорсткі колонії діаметром 1-3 мм чорного кольору, інколи із зоною гемолізу навколо них.

Виділені чисті культури ідентифікують заморфологічними, культуральними і біохімічними властивостями. Штами B. fragilis розкладають глюкозу, лактозу, сахарозу, не ферментують рамнозу, не утворюють індолу, але виділяють сірководень. Ключові ознаки для ідентифікації виду – ріст на середовищі з 20 % жовчних солей, резистентність до канаміцину (100 мкг), ванкоміцину (5 мкг) і колістину (10 мкг), яку визначають методом дисків.

КультуриB. melaninogenicus розкладаютьглюкозу, лактозуісахарозу, неферментують маніт, гідролізують крохмаль і глікоген. Ключовими ознаками виду є утворення пігменту, відсутність росту на жовчних середовищах, чутливість до колістину, стійкість до ванкоміцину і канаміцину.

Слід пам’ятати, що бактероїдози є класичними поліінфекціями. У зв’язку з цим монокультури виділяються рідко, а частіше у вигляді асоціацій із клостридіями, фузобактеріями, вейлонелами. Це значною мірою ускладнює проведення мікробіологічної діагностики. Монокультури бактероїдів легко виділити при посівах крові та спинномозкової рідини.

При септицеміях, тяжких запальних і гангренозних процесах у крові хворих швидко і в значних кількостях виробляються антитіла. Це дає можливість провести серологічні дослідження. Високі титри антитіл визначають за допомогою реакцій аглютинації, преципітації в гелі і непрямої гемаглютинації.

Діагностика фузобактеріозів. Гнійні і гангренозні процеси, особливо в ротовійпорожнині, вверхніхдихальнихшляхахісечостатевихорганахможутьспри-

чинити і фузобактерії. Лабораторну діагностику захворювань проводять за тими жметодами, щоі приінших анаеробних інфекціях. Використовуютьмікроскопічний, бактеріологічний і біологічний методи.

Бактеріоскопічні дослідження проводять при діагностиці уражень шкіри і слизових оболонок. Матеріал для виготовлення мазків беруть на межі здорової і ураженої тканини. Для забарвлення використовують метод Грама або Лефлера. При мікроскопії F. nucleatum і F. necrophorum виглядають як довгі грамнегативні бактерії веретеноподібної форми із загостреними кінцями, інколи з гранулами в середині клітин. Вони не мають ні спор, ні капсул.

Для бактеріологічного дослідження беруть гній із виразокабопорожнинпри ураженні внутрішніх органів. Посіви роблять на сироваткові і кров’яні середовища. Асцитична рідина, цистеїн, екстракт із дріжджів і вуглекислий газ стимулюють ріст фузобактерій. Вони ростуть у присутності генціанового фіолетового та інших барвників, що використовують для виготовлення селективних середовищ. Напечінковомуабосерцево-мозковому бульйонізглюкозоюпідвазеліновиммаслом фузобактерії утворюють гранулярний і слизовий осад та помутніння з характерним запахом сиру. На сироватковому агарі в строго анаеробних умовах вони ростуть у вигляді маленьких (1-2 мм), круглих, опуклих, непрозорих колоній із жовтуватим центром. На кров’яному агарі навколо них виникають зони гемолізу.

В разі отримання чистихкультурїх ідентифікують заморфологічними, культуральними і біохімічними ознаками. Ріст фузобактерій пригнічують жовчні кислоти, колістин і канаміцин, але не ванкоміцин. Вони утворюють велику кількість масляної кислоти.

Практичне значення має виявлення симбіозу Fusobacterium necrophorum і Treponema vincentiiприерозивно-некротичнійангініСимановського-Плаута-Вен- сана, а також при ерозивно-некротичних ураженнях чоловічих і рідше жіночих статевих органів.

Мікробіологічна діагностика цих захворювань часто обмежується мікроскопічним дослідженням патологічного матеріалу (рис. 77).

Біологічнийметодчастішевикористовуютьприроботізсильнозабрудненим сторонньою мікрофлорою матеріалом, який вводять білим мишам підшкірно біля кореня хвоста.

Післязагибелітваринумісцінекрозунамежіздоровоїіураженоїтканинилегковиявляютьзбудника мікроскопічно або виділяють його чисту культуру при некротичній ангіні.

Діагностикавейлонельозу. Дрібні, грамнега-

тивні аспорогенні анаеробні коки (вейлонели) постійно знаходяться в ротовій порожнині, дихальних шляхах і кишечному тракті як представники фонового мікробіоценозу. Самостійно вони рідко спричиняютьрозвитокпатологічнихпроцесів. Частішевасоціаціїзіншимипатогеннимианаероба-

ми і аеробами здатні викликати абсцеси м’яких тканин, ранові інфекції і навіть септичні стани.

Прилабораторнійдіагностицівейлонельозупатологічнийматеріалдосліджують мікроскопічно і бактеріологічно. У мазках, забарвлених за Грамом, V. atipica і V. parvula мають вигляд кокоподібних бактерій діаметром 0,3-0,5 мкм, що розташовуються парами, короткими ланцюжками або хаотичними скупченнями.

На молочному агарі в анаеробних умовах основні види вейлонел утворюють непрозорі, ромбоабо зіркоподібні колонії розміром 1-3 мм. Вони не виділяють каталазу, нерозкладаютьвуглеводів, нерозріджуютьжелатин, неутворюютьіндол, стійкі до ванкоміцину (500 мкг). Виділено декілька сероварів кожного виду, але серологічна ідентифікація вейлонел у звичайних бактеріологічних лабораторіях не проводиться.

Пептококові і пептострептококові анаеробні інфекції. В окремих випад-

кахгнійніігнійно-септичнізахворювання(плеврит, тонзиліт, пієліт, цистит, апендицит, післяпологовий сепсис, нагноєння ран та ін.) викликають грампозитивні коки родини Peptоcoccaceae. Ці умовно-патогенні мікроорганізми належать до двох родів: Peptococcus (основні види – P. niger, P. activus) і Peptostreptococcus (P. anaerobius, P. productus, P. prevotii). Вониналежатьдофоновоїмікрофлорисли-

зовихоболонокіпорожнинздоровихлюдей. Відхворихвиділяютьсяпереважнов асоціаціях з іншими бактеріями і дуже рідко як монозбудники.

Матеріалом для дослідження служить гній, слиз, кров, сеча, випорожнення, рановий вміст тощо. Лабораторна діагностика включає мікроскопію клінічного матеріалу і посіви з метою виділення чистих культур чи їх асоціацій.

Умазках, забарвленихзаГрамом, пептококидуженагадуютьстафілококів. Вони розташовуютьсягрупками, парами, тетрадами. Петострептококимаютькулясту або овоїдну форми, розташовуються у вигляді ланцюжків, рідше парами.

Для посівів найчастіше використовують кров’яний агар (краще з додаванням геміну, вітаміну К, неоміцину), рідше – агар на основі настою серця бика і тканини мозку, середовище для вирощування бруцел, тіогліколевий бульйон. На кров’яних середовищах в анаеробних умовах через 48 год колонії пептококів і пептострептококів дрібні, круглі, опуклі, як правило, прозорі. КолоніїPeptostreptococcus anaerobius дещо більші за розміром, каламутні, мають характерний солодкуватий запах. ШтамиPeptococcus nigerутворюютьчорніколонії. Культурианаеробнихкоків нечутливідодіїнеоміцину, якийпригнічуєрістграмнегативнихбактерій, особливо протею, щополегшуєвиділеннякультурізматеріалів, густоконтамінованихсупутньоюмікрофлорою. Peptostreptococcus anaerobius дуже чутливийдоатенолсульфату натрію, що використовують для диференціальної діагностики методом дисків.

Виділенікультурианаеробнихкоківідентифікуютьзаморфологічними, культуральними і біохімічними ознаками. Пептококи не розкладають вуглеводів, не розріджують желатин, але виділяють сірководень. Peptostreptococcus anaerobius ферментує лише глюкозу, а Peptostreptococcus productus – глюкозу, лактозу, мальтозу, маніт і ксилозу, звурджує молоко.

Серологічні методи діагностики поки що тільки розробляються.

Дифтерія

Дифтерія – гостра, переважно дитяча інфекційна хвороба, яка проявляється характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника та сильною інтоксикацією організму дифтерійним екзотоксином. Збудником її є Corynebacterium diphtheriaе, що належить до роду коринебактерій. До цього роду входить ще біля 20 видів бактерій, патогенних для людей, тварин і рослин. З них найбільше значення для практичної медицини мають наступні:

1.C. ulcerans – може викликати фарингіти, ураження шкіри; її виявляють і в здорових людей, у молочних продуктах і тарі для їх перевезення; деякі штами токсигенні.

2.C. jeikeium (раніше коринебактерії JK) – спричиняє пневмонію, ендокардит, перитоніт, інфікує рани, шкіру.

3.C. cistitidis (раніше коринебактерії групи D2) – ініціює утворення камінців

усечовивідних шляхах та пневмонію.

4.C. minutissimum – викликає еритразми, абсцеси легень, ендокардити.

5.C. haemolyticum – може викликати тонзиліти, целюліти, абсцеси мозку, остеомієліти, хронічні дерматити.

6.С. xerosis – раніше вважали збудником ксерозу (хронічного кон’юнктиві-

ту), тепер її відносять до сапрофітів.

7. C. pseudodiphtheriticum – сапрофіт, проживає на слизовій оболонці носоглотки людини.

Взяття і доставка матеріалу до лабораторії. Матеріалом для досліджен-

ня є плівка з мигдаликів, дужок, піднебіння, язичка, слиз із зіва та носа, рідше виділеннязока, вуха, рани, піхви, ураженоїділянкишкіри. Навимогуепідеміолога досліджують змиви з іграшок та інших предметів, деякі харчові продукти (молоко, морозиво тощо). Матеріал потрібно брати до початку етіотропного лікування натще або через 2 год після прийому їжі.

Для взяття матеріалу використовують тампони, сухі або попередньо змочені 5 % розчином гліцерину, вміщені в пробірку й простерилізовані разом з нею. Досліджуваний матеріал із ротоглотки і носа беруть двома окремими тампонами, намагаючись взяти його на межі здорової й ураженої ділянки обертальними рухами, не торкаючись тампоном слизової щік, зубів та язика, який притискають шпателем. При ларингоскопії плівку або слиз беруть безпосередньо з гортані. Плівки та слиз із рота і носа беруть обов’язково в усіх випадках, навіть при дифтерії рідких локалізацій (шкіра, рана, око, вухо, вульва).

Якщонеобхіднопровестипервиннубактеріоскопіюнавимогулікаря, матеріал беруть окремим (додатковим) тампоном або направляють частину знятої плівки, ретельно розтертої між двома предметними скельцями.

Тампони після забору матеріалу вміщують у ті ж самі пробірки, на яких надписуютьномер, датуічасвідбору, прізвищелікаря. Вониповиннібутидоставлені долабораторіїнепізніше3-хгодпіслявзяттяматеріалу. Якщосхемазаборупередбачає посів біля ліжка хворого, то пробірки і чашки з посівами негайно направля-

ють до лабораторії або інкубують при 37 °С і доставляють через 20-23 год, в холодну пору в сумках із грілками.

Бактеріоскопічне дослідження матеріалу від хворого проводять лише на вимогу лікаря і тільки для того, щоб розпізнати некротичну ангіну Симановсько- го-Плаута-Венсана (виявлення веретеноподібних паличок і спірохет Венсана, які при звичайних методах культивування не ростуть).

Впродовж багатьох років мікроскопічне дослідження і виявлення зерен волютину, забарвлених заметодамиЛеффлера і Нейссера, було основоюлабораторноїдіагностикидифтеріїтавиявленнябактеріоносійства. Тепер, узв’язкузмінливістю дифтерійних бактерій під впливом антибіотиків, первинна мікроскопія досліджуваного матеріалу не рекомендується.

Бактеріоскопічне дослідження проводиться з метою ідентифікації нетипових колонійнакров’яно-телуритовихсередовищахтаприперевірцічистотивиді- лених культур. Мазки забарвлюють за Грамом, Леффлером і Нейссером. Можна також фарбувати їх оцтовокислим метиловим фіолетовим, толуїдиновим синім або бентіазоловим і тіазиновим барвниками.

Дифтерійні палички в мазках розташовуються під кутом, у вигляді латинських літер V, X, Y, або утворюють скупчення, що нагадують купку розкиданих сірників. Волютинові зерна розташовуються, як правило, на полюсах мікробних клітин. (див. вкл., рис. 17 і 18). Псевдодифтерійні бактерії та дифтероїди розміщуються паралельно (у вигляді “частоколу”) і, звичайно, не мають зерен волютину. Зерна Бабеша-Ернста можна також виявити за допомогою люмінесцентної мікроскопії при забарвленні мазків корифосфіном. Зерна набувають оранжевочервоного кольору на фоні жовто-зелених тіл бактерійних клітин.

Бактеріологічне дослідження. Клінічний матеріал засівають на кров’яний агар і кров’яно-телуритовий агар (або середовище Клауберга ІІ), розлиті у чашки Петрі. Посів на кров’яний агар необхідний для виявлення й іншої мікрофлори. Крімтого, деякіштамиC.diphtheriae чутливідодіїтелуритукалію, томуїхрістна телуритовихсередовищахможепригнічуватись. Длявиявленнядифтерійногобактеріоносійства посіви роблять тільки на кров’яно-телуритовий агар, оскільки в посівномуматеріаліможеміститисьневеликакількістьдифтерійнихпаличок, ріст яких на неселективних середовищах буде пригнічуватись іншою мікрофлорою. При цьому допускається використання і транспортного середовища.

Кров’яно-телуриновий агар. До100 мл2 % розплавленогойохолодженого до 50 °С живильного агару рН 7,6 добавляють 10-15 мл дефібринованої крові та 2 мл 2 % розчину телуриту калію. Суміш ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі шаром, товщиною 3-4 мм.

Середовище Клауберга ІІ. До 100 мл 3 % живильного агару рН 7,6, розплавленого й охолодженого до 50 °С, додають 3 мл 2 % розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової суміші та 50 мл гемолізованої крові. Гліцериновусуміш готують шляхомдодавання 20 мл стерильного гліцерину до 40 мл дефібринованої крові. Суміш можна зберігати в холодильнику протягом 4-х місяців. Для приготування гемолізованої (“лакової”) крові до 34 мл стерильної дистильованої води додають 16 мл дефібринованої крові.

Транспортненапіврідке середовище. До100 млперевару Хоттінгераабом’ясо-пеп- тонного бульйону додають 1 г будь-якого комерційного агару, встановлюють рН 7,6, стерилізують в автоклаві при 112 °С 30 хв, асептично додають 10 мл сироватки та 1 мл 2 % телуриту калію. Середовищерозливаютьупробіркипо5 мл. Приможливостівикористову-

ють і більш складне транспортне середовище ЕМЕС (AMIES), модифіковане Стюартом.

Посів від одногохворого роблять на одну чашку, використовуючи при цьому одну половину середовища для посіву із ротоглотки (мигдаликів, дужок, язичка), а другу – для посіву іншим тампоном із носа. Якщо є досліджуваний матеріал із шкіри, ока, вухата інших локалізацій – додають ще одну чашку. Не можна засівати матеріал від кількох хворих на одну чашку. Середовища перед посівом зігрівають у термостаті 15-20 хв.

При посіві досліджуваного матеріалу його втирають тампоном спочатку в окрему ділянку кров’яного агару площею 2× 1 см, потім аналогічно на кров’янотелуритовому агарі (або середовищі Клауберга ІІ), при цьому тампон весь час повертають, щоб засіяти з нього весь матеріал. Потім тим же тампоном штрихами засіваютьрештуповерхнісередовища(половинучашки). Така технікапосівудозволяє отримати ізольовані колонії (чисту культуру), які використовують безпосередньо з чашки для визначення токсигенності та подальшої їх ідентифікації. Засіяні чашки або пробірки з транспортним середовищем інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-24 год.

На другий день за допомогою стереоскопічного мікроскопа досліджують характерколоній. Якщоріствідсутнійнаобохсередовищах, роблятьповторнийзабір матеріалу.

Чашки з типовими і підозрілими на C.diphtheriae колоніями відбирають для подальшої ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопію підозрілих колоній можна і не проводити.

Колоніїдифтерійнихпаличокнакров’яномуагарібілуватогоабожовтуватого кольору, непрозорі, круглої, злегка опуклої форми, діаметром 1-2 мм. Звичайно вонимаютьмаслянистуконсистенцію, хочдеякіможутьутворюватикрихкішорсткі R-колонії.

Накров’яно-телуритовихсередовищахколоніїC.diphtheriae через24 годросту мають сірий колір, опуклі, з рівним краєм, в’язкі. Через 48 год вони набувають темно-сірогоабочорногокольорузметалевимблиском, рівнимиабозлегкафестончастими краями, гладенькою або з радіально посмугованою поверхнею (R-фор- ми), в’язкі чи крихкі при дотику петлею.

За структурою 48-годинних колоній на телуритових середовищах і деякими ферментативними ознаками збудника дифтерії поділяють на чотири культураль-

но-біохімічних варіанти (біовари) – gravis, mitis, belfanti, intermedius.

Біовар gravis звичайно утворює сірі або чорні матові сухі колонії, крихкі, плоскі, гладенькі, діаметром 1,5-2 мм, із радіально посмугованою поверхнею; він високотоксичний, не викликає гемолізу, розкладає крохмаль і глікоген.

Біовари mitis та belfanti ростуть у вигляді сірих або чорних, круглих гладеньких опуклих колонійзрівнимикраями, діаметром 1-1,5 мм; ціваріанти менштоксичні, викликають гемоліз, але не розкладають крохмаль і глікоген.

Біовар intermedius утворює дрібні, сірі, прозорі колонії, діаметром 0,5-1 мм, із плоскою гладенькою поверхнею; він слаботоксичний, не розщеплює крохмалю і глікогену (див. вкл., рис. 19 і 20).

Якщотиповийріствідсутній, зінших, сумнівнихколонійготуютьмазки. При виявленні в них спорових паличок, коків, дріжджів та ін., дослідження на дифтерію припиняють і дають негативну відповідь. Проте, важливо пам’ятати, що дифтерійнібактерії, якіутворилинетиповіколоніїнасередовищахзінгібіторамиросту (телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, але зберігають поліморфізм та характерне розташування.

При рості типових колоній відразу ж приступають до вивчення їх токсигенності та ідентифікації. Токсигенні властивості досліджують не менше як у 2-х ізольованих колоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середовище для визначення токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а другої половини – на скошений сироватковий агар для виділення чистої культури та збереження її до закінчення лабораторної діагностики. В разі, якщо на чашці виростають одночасно токсигенні та нетоксигенні різновидиC. diphtheriaе, необхіднопримножинномуростіпідозрілихколонійдослідититоксигеннівластивості біля 20 колоній, засіваючи в одну бляшку матеріал із 5-6 колоній. При рості лише однієї колонії, її засівають на середовище для визначення токсигенності і, не прожарюючи петлю, – у пробірку із середовищем Пізу.

Якщозастосовувалитранспортнесередовище, висівізньогороблятьнащільні кров’яно-телуритові середовища.

На третій день, при появі специфічних ліній преципітації в агаровому гелі й позитивній пробі на цистиназу, виділену культуру визначають як токсигенну С. diphtheriае. Якщо лінії преципітації через 24 год відсутні, чашки інкубують ще протягом доби. В разі негативної проби Пізу культуру ідентифікують як інший вид коринебактерій.

Чисту культуру на скошеному сироватковому агарі висівають на вуглеводневі середовища з глюкозою, сахарозою, розчинним крохмалем, ставлять проби на виявлення уреази, піразинамідази та нітратредуктази.

На четвертий день роблять облік результатів усіх посівів і видають аргументований бактеріологічний висновок про виділену культуру.

Використовують такі методи ідентифікації коринебактерій.

Визначення токсигенності in vitro. В його основі лежить взаємодія токсинузантитоксиномвагаровомугелі. Вмісцяхоптимальногокількісногоспіввідношення токсину й антитоксину в товщі агару випадає преципітат у вигляді тонких ніжних білих ліній (“стріли”, “вусики”). Цей тест в багатьох країнах за кордоном називають Елек-тестом.

Пробу на токсигенність, якправило, проводятьізчистими культурами. Можна визначити її і з культурами, забрудненими сторонньою мікрофлорою, що на добу прискорює лабораторну діагностику дифтерії. Але при негативній пробі її повторюють з виділеною чистою культурою.

Для постановки цієї проби мікробіологічна промисловість випускає спеціальне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних