Metod_Medical_chem_1_Med_M-2

Ізоелектричний стан білка. Ізоелектрична точка та методи її визначення. Іонний стан біополімерів в водних розчинах.

3.2. Блок інформації

Високомолекулярні сполуки (ВМР) або полімери – це речовини, відносна молекулярна маса яких становить від десятків тисяч до декількох мільйонів одиниць маси. ВМР мають гігантські молекули, які складаються з великої кількості окремих груп атомів, т.з. ланок, пов’язаних між собою ковалентними хімічними зв’язками.

ВМР можна розділити на природні – білки, вуглеводи, РНК і синтетичні – поліхлорвініл, капрон, лавсан, поліетилен та інші. Одержати синтетичні ВМР можна за допомогою реакцій полімеризації та поліконденсації.

Розчини ВМР називають гідрофільними золями і відносять до колоїдів завдяки спільності багатьох властивостей. Вони мають однакові з гетерозолями розміри частинок 10–8 – 10 –9 м, невеликі швидкості дифузії, утворюють невисокий осмотичний тиск, проявляють здатність до коагуляції. І все ж це дещо особливі розчини, які утворюються при звичайному розчиненні, є стійкими, а процеси утворення цих розчинів і навпаки – виділення ВМР із розчину – є зворотними.

Розчинення ВМР відбувається самочинно через стадію набрякання, яке у випадку необмеженого набрякання призводить до утворення розчину. Розчинення ВМР можливе лише у споріднених розчинниках, тому їх називають ліофільними золями. Гідрофільні полімери розчиняються у воді, а олеофільні – у вуглеводнях (желатина розчиняється у воді, а каучук – у бензолі). Процесові розчинення ВМР передує процес набрякання – проникнення молекул розчинника до складної структури молекули полімеру. Розрізняють набрякання обмежене, в результаті якого утворюється сольватний комплекс (гель). Необмежене набрякання закінчується розчиненням ВМР і утворенням ліофільного золю, колоїдного розчину.

Кількісною характеристикою набрякання вважається ступінь набрякання (a), який вказує на відносне збільшення маси полімеру до і після процесу на-

брякання: α = m − m0 × 100%. Ступінь набрякання може змінюватись у широ- m0

кому діапазоні й досягати величин понад 100 % – 200 % ..

На ступінь набрякання впливають різні фактори: природа полімеру і розчинника, температура, додавання електроліту та рН середовища. Останній фактор особливо впливає на поліелектроліти. Вплив електролітів полягає у тому, що деякі аніони змінюють структуру води, дисперизуючи її і цим сприяють перебігові набрякання. До таких йонів належать CNS– > KBr– ... I– > NO3– > Cl– . У той же час інші йони (SO42– > CH3COO– > C2O42– ) наближують структуру води до структури льоду і цим затримують набрякання. У цілому ліотропний ряд Гофмайстера можна подати так:

CNS– > I– > KBr– > NO3– > Cl– > CH3COO– > SO42– .

81

Розчини ВМР мають біологічне значення та медичне застосування. Так, кров, лімфа та клітинні соки сприяють процесам обміну речовин в організмі. Розчини реополіглюкіну, гемодезу та неогемодезу використовуються як кровозамінники.

Поліелектролітами називають ВМР, що містять йоногенні групи, здатні в розчинах розпадатись на йони. За характером утворюваних йонів поліелектроліти розподіляють на три категорії:

–поліелектроліти, що містять кислотні групи (– СОО– , –SO 3– );

–поліелектроліти, які містять основні групи (–NH 3+);

–поліелектроліти, що містять одночасно як кислотну, так і основну групи. Такі поліелектроліти називаються поліамфолітами.

Білки є важливими представниками поліелектролітів, що містять у бокових ланцюгах амінокислот багато кислотних і основних функціональних груп. Амінокислоти у водних розчинах містяться у формі біполярних йонів:

H2N–R–COOH +H3N–R–COO – .

У кислому середовищі, коли внаслідок надлишку йонів Н+ зменшується йонізація карбоксильних груп, молекула білка веде себе, як основа і набуває додатного заряду:

+H3N–R–COO – + H+ +H3N–R–COOH.

У лужному середовищі, навпаки, зменшується йонізація аміногруп, молекула білка поводиться як кислота і набуває від’ємного заряду:

+H3N–R–COO – + OH– H2N–R–COO – + H2O.

Таким чином, заряд білка залежить від співвідношення у його молекулах карбоксильних та амінних груп, а також від рН середовища. Якщо при йонізації на поверхні білка виникає однакова кількість додатних і від’ємних зарядів, тобто сума електричних зарядів дорівнює нулю (ζ = 0), то такий стан білка називається ізоелектричним (ІЕС). Значення рН розчину, при якому білок перебуває в ізоелектричному стані, називають ізоелектричною точкою (рНІЕТ). При цьому значенні рН протилежно заряджені групи –NH 3+ і – СОО– притягуються одна до одної, і молекула закручується у спіраль, згортаючись у клубок. У зарядженому стані ланцюги білків мають витягнуту форму внаслідок відштовхування однойменно заряджених груп.

В ізоелектричній точці набрякання мінімальне, оскільки ступінь гідратації йоногенних груп найменша. Зміна рН у кислу або лужну ділянку відносно ізоелектричної точки призводить до зростання ступеня набрякання. Це пояснюється тим, що поява електричного заряду посилює ступінь гідратації макромолекул, а також збільшує сили електростатичного відштовхування між ними. Саме різким зменшенням рН і набряканням живої тканини за рахунок сусідніх ділянок пояснюють виникнення набряків при укусах комарів, бджіл, мурашок.

Значення ІЕТ білків залежить від переважання в його молекулах моноамінодикарбонових чи діаміномонокарбонових кислот. Більшість природних білків містять значні кількості дикарбонових амінокислот (глютамінової, аспара-

82

гінової) і тому належать до кислих білків, тобто їх ІЕТ лежить у кислій ділянці рН. Невелика група основних білків, у молекулах яких переважають вільні групи –NH 2 за рахунок підвищеного вмісту діамінових амінокислот (лізину, аргініну, та ін.).

3.3.Література

1.Мороз А.С. , Луцевич Д.Д. , Яворська Л.П. Медична хімія (2-ге вид.).– Вінниця: Нова Книга, 2008.– С. 676–729.

2.Медицинская химия/ В.А. Калибабчук, Л.И. Грищенко, В.И. Галинская и др.; под ред. В.А. Калибабчук.– К.: Медицина, 2008.– С. 318–341.

3.Мороз А.С., Ковальова А.Г. Фізична та колоїдна хімія. – Львів, 1994. –

С.231-248.

4.Красовский И.В., Вайль Е.И., Безуглый В.Д. Физическая и коллоидная химия, – Київ: Вища школа, 1983. – С. 325-329.5.

3.4.Матеріали для самоконтролю

а) Дати письмові відповіді на контрольні питання

1.Дайте визначення поняттям ВМР, гель, набрякання, желатинування.

2.Якими методами можна одержати ВМР та розчини ВМР? Навести приклади.

3.Спільні і відмінні властивості розчинів ВМР від справжніх розчинів і ліофобних золів.

4.Набрякання і розчинення полімерів. Механізм і стадії набрякання. Типи набрякання.

5.Ступінь набрякання. Представити графік залежності ступеня набрякання від часу для обмеженого і необмеженого набрякання.

6.Пояснити вплив природи електролітів на ступінь набрякання. Ліотропний ряд Гофмайстера.

7.Показати роль явища набрякання у фізіології рослин і тварин.

8.Що таке драглювання полімерів та які фактори впливають на утворення драглів?

9.Що таке онкотичний тиск плазми крові?

10.Поліелектроліти. Амфотерність білків. Заряд білкової молекули в залежності від рН середовища.

11.Ізоелектричний стан білка. Ізоелектрична точка та методи її визначення. Від чого залежить рНІЕТ білка?

12.Властивості розчинів ВМР (в’язкість, осмотичний тиск, тиксотропія, пластифікація і утворення драглів).

13.Порушення стійкості розчинів ВМР. Суть процесу висолювання. Фактори, які впливають на явище висолювання білків. Розмістити аніони в порядку

зростання їх висолювальної дії: CH3COO– , Cl– , I– , SO42– , SCN– , NO3– . Від чого залежить їх висолювальна дія?

14.Біологічне значення полімерів. Значення та застосування розчинів ВМР у медичній та фармацевтичній практиці.

б) Алгоритми розв’ язування типових задач

83

Задача 1. Зразок натурального каучуку об’ємом 1,094×10–4 м3 (V0) помістили в сірковуглець. Через 48 год. витримування при 293 К об’єм зразка став 9,204×10–4 м3 (V). Вирахувати ступінь набрякання полімеру (в

%).

Алгоритм розв’ язування

Ступінь набрякання полімеру в % вираховуємо за формулою:

= 7,4132 ×100% = 741,32%

Задача 2. Вирахувати молярну масу етилклітковини (в кг/моль), якщо її розчин в аніліні з концентрацією 4,9 кг/м3 при 313 К має осмотичний тиск 250,9 Па. Константа “ b” у рівнянні Галлера дорівнює 0,52 Па×м6/кг2.

Алгоритм розв’ язання

Осмометричний метод визначення молярної маси полімерів грунтується на законі Вант-Гоффа, згідно з яким осмотичний тиск розчину є прямопропорційний його молярній концентрації. Однак для розчинів ВМР необхідно врахувати вплив гнучкості ланцюгів молекул ВМР, які поводять себе, як декілька коротких ланцюгів. Тому для визначення осмотичного тиску розчинів ВМР використовують рівняння галлера, яке враховує назване явище:

Відповідь: молярна маса етилклітковини 53,5 кг/моль.

Задача 3. Альбумін сироватки крові (рНІЕТ = 4,64) знаходиться у буферному розчині з [H+] = 10–6 моль/л. До якого з електродів будуть рухатися частинки білка при електрофорезі?

84

Алгоритм розв’ язання

1. Вираховуємо рН буферного розчину, в якому [H+] = 10–6 моль/л: pH = –lg [H +] = –lg10 –6 = 6.

2.Оскільки рН буферного розчину більший від ІЕТ, частинки альбуміну матимуть від’ємний заряд:

+NH3– R–COO – + OH– ® NH3OH–R–COO – .

Тому під час електрофорезу вони рухатимуться до позитивно зарядженого електрода – анода.

Відповідь: частинки альбуміну рухатимуться до анода.

Задача 4. Час витікання розчину яєчного альбуміну густиною 1200 кг/м3 при 293 К у віскозиметрі Оствальда становить 27 с, а дистильованої води

– 15 с. Вирахувати абсолютну в’язкість розчину альбуміну (Па×с), знаючи, що густина води 1000 кг/м3 і в’язкість 1,005×10–3 Па×с.

Алгоритм розв’ язання

В’язкість розчину можна обчислити за формулою:

Відповідь: абсолютна в’язкість розчину альбуміну становить 2,2×10–3 Па×с.

в) Задачі для самостійного розв’язання

1.Желатина, рНІЕТ якої дорівнює 4,7, поміщена у розчин, де [H+] у 1000 разів більша, ніж у воді. Який заряд частинок желатини в розчині?

Відповідь: позитивний.

2.Час витікання розчину желатини густиною 1050 кг/м3 у віскозиметрі Оствальда за 298 К дорівнює 25 с, а дистильованої води – 10 с. Вирахувати відносну в’язкість розчину желатини, знаючи, що в’язкість води дорівнює

0,8937×10–3 Па×с, а густина – 997,04 кг/м3.

Відповідь: 2,6.

3.Вирахувати за 291 К час витікання (с) із віскозиметра Оствальда розчину нітроклітковини густиною 1120 кг/м3, що має абсолютну в’язкість 1,52×10–3 Па×с, якщо такий же об’єм води витікає за 12 с. Значення абсолютної в’язкості та густини для води відповідно дорівнюють: 1,11×10–3 Па×с та

998,94 кг/м3.

Відповідь: 14,7 с.

85

4. Матеріал для аудиторної роботи

4.1. Перелік практичних завдань, які необхідно виконати на практичному занятті:

–експериментально провести визначення ступеня набрякання за допомогою набухнометра;

–встановити вплив електролітів на ступінь набрякання ВМР;

–– визначити ІЕТ желатини за набряканням;

–– вивчити вплив рН на в’язкість розчинів білків. Визначити ізоелектричну точку желатини за мінімумом в’язкості;

–– визначити ізоелектричну точку желатини за максимумом осадження.

4.2. Методика виконання практичних завдань

4.2.1. Масо-об’ємний метод визначення ступеня набрякання гелів У чистий посуд – прилад для набрякання налити очищену воду так, щоб

при повороті приладу глухим кінцем (кулькою) вниз рівень рідини приблизно сягав середини градуйованої трубки. Точно записати у таблицю 9.1 цей рівень (V0). Тоді у відкритий кінець помістити суху желатину (або інший гель) масою m, прив’язану до нитки, і, закривши корком, обережно повернути прилад у горизонтальне положення та відзначити час початку набрякання. Через кожні 15 хвилин упродовж 1 години знову переливати рідину в кульку, записувати зменшення її рівня на градуйованій трубці (V). Вирахувати ступінь набрякання гелю (і).

На міліметровому папері побудувати графік залежності ступеня набрякання від часу, відкладаючи на осі абсцис час τ. Який тип набрякання характерний для даної ВМР при кімнатній температурі?

4.2.2. Дослідження впливу електролітів на ступінь набрякання желатини У 5 пронумерованих баночок відміряти по 10–15 см3 одного з 0,1 М розчи-

нів електролітів: K2SO4, CH3COOK, KCl, KI, KCNS. Зважити відповідно 5 кусочків желатини, записати масу кожного, помістити в баночки з електролітом, залишити на 1 годину. Потім желатину вийняти, обережно просушити фільтрувальним папером і знову зважити.

86

Одержані дані записати в таблицю 9.2 і вирахувати ступінь набрякання в кожному розчині.

Таблиця 9.2

Зробити висновок про вплив аніонів на набрякання гелів. Скласти ліотропний ряд Гофмайстера і пояснити, які аніони і чому гальмують набрякання, а які сприяють йому.

4.2.3. Визначення ІЕТ желатини за набряканням

Укожну з 5 пронумерованих баночок відміряти піпеткою по 10 см3 одного

зацетатних буферних розчинів із різним рН. Зважити відповідно 5 кусочків

желатини (mo, г), помістити їх у баночки з відповідним розчином і залишити на 1 годину. Після цього розчини злити, желатину обережно висушити на фільтрувальному папері та знову зважити (m, г).

Вирахувати ступінь набрякання за формулою

На міліметровому папері побудувати графік залежності ступеня набрякання і (вісь ординат) від рН розчину (вісь абсцис). Визначити ізоелектричну точку (рНІЕТ) желатини. Зробити висновок із одержаних даних і пояснити їх.

4.2.4.Вплив рН на в’язкість розчинів білка. Визначення ізоелектричної точки желатини за мінімумом в’язкості

У п’ять пронумерованих пробірок відміряти по 10 см3 ацетатного буферного розчину з рН: 3,7; 3,9; 4,2; 4,7; 5,2. Додати у кожну пробірку по 5 см3 3% розчину желатини та перемішати.

В’язкість визначити за допомогою капілярного віскозиметра Оствальда.

87

Виміряти час витікання розчинника (τ0), а потім розчину желатини (τх) із капілярного віскозиметра Оствальда за допомогою секундоміра. Спочатку треба визначити час витікання для води, а потім для кожного з розчинів і знайти їх відносну в’язкість. Таке визначення часу витікання рідини виконати тричі і взяти середнє значення для кожного розчину. Вирахувати відносну в’язкість кожного розчину за формулою:

де: h0– відносна в’язкість води при даній температурі (1 ×10–3 Па×с); hх – відносна в’язкість досліджуваного розчину.

Результати вимірювань записати в таблицю.

На міліметровому папері побудувати графік залежності відносної в’язкості від рН.

Яке значення рН відповідає ізоелектричній точці? Пояснити вплив рН на в’язкість розчинів білка.

4.2.5. Вплив рН на стійкість розчинів білка. Визначення ізоелектричної точки желатини за максимумом осадження

В ізоелектричній точці, коли макромолекули білка згорнуті в клубок, він має найменшу стійкість і найлегше виділяється з розчину. Про зниження розчинності може свідчити помутніння рідини.

Налити у п’ять пробірок по 2 см3 одного з ацетатних буферних розчинів із такими значеннями рН: 3,8; 4,4; 4,7; 5,0 і 5,2. У кожну пробірку додати по 0,5 см3 3 % розчину желатини і добре перемішати. Потім у всі пробірки додати при інтенсивному перемішуванні по 2 см3 етилового спирту або ацетону. Залишити пробірки на 10 хвилин, після цього записати, в котрій пробірці, при якому значенні рН з’явилася найінтенсивніша каламуть. Це значення рН відповідатиме ізоелектричній точці желатини. Пояснити це явище та зробити відповідні висновки.

5. Підведення підсумків та зарахування теми

88

ДОДАТОК

Таблиця 2

Співвідношення між позасистемними одиницями та одиницями СІ

89

Таблиця 3

Стандартні термодинамічні функції деяких речовин при 298 К