u_manual

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Чистый удерживаемый объем зависит от количества сорбента в колонке, поэтому для точных физико-химических измерений используют понятие удельного удерживаемого объема (VTg). Величина VTg – это чистый удерживаемый объем, отнесенный к массе сорбента g в колонке или к площади поверхности адсорбента SК при усредненном давлении в хроматографической колонке и температуре T колонки:

Относительные параметры удерживания. Все рассматриваемые выше параметры удерживания зависят от случайных небольших колебаний параметров опыта, в частности расхода элюента и температуры термостата колонки. Для исключения этих влияний используют относительные параметры удерживания. При расчете относительного параметра удерживания (времени или объема) берут отношение чистого объема удерживания исследуемого вещества к чистому объему удерживания стандартного соединения:

Вгазовой хроматографии в качестве стандартных соединений используют н-алканы, с параметрами удерживания, близкими к параметрам удерживания исследуемого вещества. В этом случае при случайных колебаниях расхода или температуры абсолютные параметры удерживания будут изменяться, а их отношения – практически нет.

Вкачестве относительного параметра широко используют индекс Ко-

вача:

где tn, tn+1 – приведенные времена удерживания н-алканов, с числом атомов углерода в молекуле n и n + 1; tn – приведенное время удерживания исследуемого соединения. Индекс Ковача – безразмерная величина и может быть подсчитана с большой точностью, например в капиллярных колонках – до сотых долей процента. Индексы Ковача в первую очередь применяют для идентификации неизвестных веществ (проведение качественного анализа).

Изменения индексов Ковача для соединений, отличающихся природой функциональной группы, используют для оценки межмолекулярных взаимодействий. Индексами удерживания определенного набора стандартных веществ характеризуют полярность неподвижных жидких фаз и адсорбентов.

Параметры хроматографического пика. Выходной сигнал анализи-

руемого соединения имеет форму треугольника или пика, обычно это участок нулевой линии, на котором возникает сигнал при выходе анализируемого соединения из хроматографической колонки. Нулевая или базовая линия соответствует участку нулевой концентрации анализируемого соединения.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Запись пика исследуемого соединения вместе с участками нулевой линии до

ипосле пика называется хроматограммой. Высота пика – это расстояние от максимума пика до его основания, измеренное параллельно оси отклика детектора. Ширина пика у основания – отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика. Ширина пика на полувысоте – отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной параллельно основанию пика на середине его высоты. Площадь пика – это площадь части хроматограммы, заключенной между пиком и его основанием.

Важным параметром пика является коэффициент асимметрии, который применяется для сравнения различных твердых носителей, адсорбентов и всей системы хроматографа в целом. В идеальных условиях пик по форме близок к кривой Гаусса, т.е. симметричен. На практике пики по разным причинам в основном несимметричны. Асимметрия пиков ухудшает разделение

изатрудняет количественную обработку.

Асимметричные пики появляются при разделении на неоднородных сорбентах, когда концентрации анализируемых соединений соответствуют нелинейным участкам изотермы сорбции. Кроме того, это может быть вызвано в некоторых случаях кинетикой сорбции (замедленный процесс десорбции), наличием непродуваемых полостей. Асимметрию пиков оценивают относительно полуширин пиков на половине высоты (рис. 6.7) отношением отрезка БВ к АБ либо на 1/10 высоты пика от основания отношением отрезков ДЕ к ГД. Точнее пользоваться отношением площадей половин пика – отношением заштрихованной части пика к незаштрихованной части (рис. 6.7).

Рис. 6.7. Оценка асимметричности пиков

Асимметрия пиков может быть вызвана размыванием полос в колонке. Обычно выделяют три вида размывания полос:

–размывание, связанное с различной скоростью движения по слою сорбента зон с разной концентрацией (зависит от формы изотермы сорбции);

–диффузионные размывания (молекулярная диффузия, вихревая диффузия, динамическое размывание, стеночный эффект);

–кинетическое размывание, связанное со скоростью внешнего и внутреннего массообмена.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Первый вид размывания наблюдается в том случае, когда концентрация вещества соответствует нелинейному участку изотермы сорбции. На рис. 6.8 показано размывание полос для различных типов изотерм. В случае нелинейности изотермы сорбции линейная скорость перемещения зоны вещества по слою сорбента

где U – линейная скорость элюента.

При линейной изотерме сорбции (изотерма Генри) отношение а/с постоянно во всем диапазоне концентраций, поэтому искажение формы зон не происходит, следовательно, зарегистрированный пик будет симметричным. В случае нелинейной изотермы сорбции отношение а к с изменяется с концентрацией. Для выпуклой изотермы (изотермы Лэнгмюра) с повышением концентрации величина а/с уменьшается, а скорость продвижения участков зон с большими концентрациями возрастает. В случае вогнутой изотермы (рис. 6.8, в), наоборот, скорость продвижения участков зон с меньшими концентрациями будет больше. Это единственный вид размывания, который можно полностью исключить. Для этого нужно выбрать адсорбент с однородной поверхностью с линейной изотермой для анализируемых концентраций.

Рис. 6.8. Размывание полос для различных типов изотерм: а – линейная изотерма; б – изотерма Лэнгмюра (выпуклая изотерма); в – вогнутая изотерма

Молекулярная диффузия. В хроматографических колонках это размывание рассматривают вдоль колонки, размывание в других направлениях ограничено стенками колонки, поэтому в этом случае часто используют термин «продольная диффузия».

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Вихревая диффузия имеет место только в набивных колонках и определяется неоднородностью набивки, разным сопротивлением потоку в разных частях сечения колонки. Общий поток элюента при попадании в колонку распадается на отдельные микропотоки между зернами. Если сопротивление по сечению неоднородно, то там, где сопротивление меньше, микропоток будет продвигаться быстрее; наоборот, там, где сопротивление больше, микропоток будет двигаться медленнее. Это приведет к дополнительному размыванию. Чтобы уменьшить вклад вихревой диффузии, нужно уменьшать размер зерен, использовать более узкий фракционный состав зерен, исключать пыль и заполнять колонку с максимальной плотностью.

Динамическое размывание наблюдается в пустых незаполненных (т.е. капиллярных) колонках, оно связано с профилем скоростей по сечению в пустых трубках. В центре скорость потока больше, чем у стенок, в результате происходит искажение формы полосы и имеет место дополнительное размывание.

Стеночный эффект. Плотность набивки на единицу объема около стенок всегда меньше, а доля пустот больше, чем в центре колонки, особенно при использовании зерен крупного размера. Это приводит к тому, что скорость элюента около стенок больше, чем в центре колонки. В результате возникает дополнительное размывание, так называемый стеночный эффект. Стеночный эффект может вносить большой вклад, когда диаметр колонок значительно больше высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ), т.е. в препаративной хроматографии. В аналитических колонках небольшого диаметра (внутренний диаметр 2–4 мм) размывание за счет стеночного эффекта мало и им пренебрегают.

Кинетическое размывание. Задержка массообмена с поверхностью адсорбента вследствие медленности процессов адсорбции и десорбции также приводит к размыванию полосы. Задержка при адсорбции приводит к пр о- движению компонента вперед, т.е. к размыванию переднего фронта полос, а задержка при десорбции приводит к размыванию заднего фронта. В том случае, когда скорости адсорбции и десорбции неодинаковы, такое размывание может быть несимметричным.

Все перечисленные причины искажения хроматографических пиков можно описать математическими зависимостями, а их суммарное действие выразить уравнением Ван-Деемтера:

H = A + B/U + cU, (6.14)

где каждое из трех слагаемых по порядку соответствует ранее описанным факторам: А – степень неоднородности структуры упакованного в колонку сорбента; В – коэффициент, учитывающий вклад диффузии данного сорбата в подвижной и неподвижной фазах; с – константа, определяющая массообмен сорбата между сорбентом и элюентом; U – линейная скорость потока элюента.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Рис. 6.9. График зависимости H от U (уравнение Ван-Деемтера)

На графике зависимости Н (высота эквивалентной теоретической тарелки) от U (рис. 6.9) можно в общем виде оценить величины А, В и с. Обращает на себя внимание несимметричность ветвей кривой, следовательно, превышение оптимальной скорости потока ведет к меньшей потере эффективности, чем работа колонки со скоростью потока ниже оптимальной.

Размывание приводит к уширению пика, что отражается на эффективности, которая выражается числом теоретических тарелок N и вычисляется по формуле

половины его высоты на подъеме, до половины высоты на спаде. Отношение длины колонки к ее эффективности называется высотой

эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) – Н. Обе эти величины имеют конкретный смысл: для N – число актов сорбции-десорбции, произошедших с веществом при его движении по колонке; для Н – высота слоя сорбента в колонке, на котором происходит единичный акт сорбции-десорбции. Следовательно, эффективность прямо пропорциональна длине колонки.

6.2.3. Газоваяхроматография

Как уже отмечалось выше, газовая хроматография (ГХ), вид хроматографии, в которой подвижной фазой служит газ (пар). Разделение компонентов в ГХ основано на различии скоростей движения и размывания концентрационных зон исследуемых веществ, движущихся в потоке газовой фазы относительно слоя неподвижной фазы, причем эти вещества распределены между обеими фазами. Газ-носитель (воздух, Не, N2, Аr, СО2 и др.) должен обычно иметь небольшую вязкость и обеспечивать высокую чувствительность детектирования. Далее приводятся основные характеристики ГХ.

Основные уравнения, используемые в газовой хроматографии, приведены ниже.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Коэффициент распределения – отношение концентраций исследуемого соединения в неподвижной и подвижной фазах в равновесных условиях:

Фазовое отношение – это отношение объемов подвижной и неподвижной фаз в колонке:

Фактор удерживания (фактор емкости) – это отношение приведенных времен удерживания к мертвому времени:

Фактор разделения – величина, характеризующая селективность разделительной системы, равная отношению факторов удерживания или приведенных времен удерживания двух соседних пиков на хроматограмме:

Эффективность колонки – характеристика степени размывания полос в колонке, определяется числом теоретических тарелок N или H,

где L – длина колонки; N – безразмерная величина; Н имеет размерность длины, обычно мм.

Разрешение Rs – это отношение расстояния между максимумами исследуемых соседних пиков к сумме их полуширин, выраженных в одних и тех же единицах измерения:

Связь степени разрешения с фактором разделенияα, фактором удерживания k и эффективностью N отражена в соотношении

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Влияние экспериментальных параметров на хроматографическое разделение (на величины α, R и N).

Влияние природы сорбента. Природа сорбента играет решающую роль в разделении компонентов. Разделение происходит за счет различий межмолекулярных взаимодействий разделяемых молекул с сорбентом. Селективность разделения определяется природой сорбента. В большинстве случаев селективность разделения (величинаα) уменьшается с повышением темп е- ратуры.

Длина колонки. Степень разделения пропорциональна квадратному корню от длины колонки, эффективность прямо пропорциональна длине колонки.

Сечение колонки. С уменьшением сечения колонки (диаметра) возрастает эффективность и степень разрешения колонки.

Размер зерен сорбента. Размывание хроматографических полос, эффективность в значительной степени зависят от размера зерен сорбента. Вихревая диффузия и внешний массообмен сильно зависят от диаметра зерен сорбента.

Толщина жидкой пленки на носителе. С увеличением толщины пленки жидкой фазы (в случае газожидкостной хроматографии) увеличиваются времена удерживания, затрудняется внутренний массообмен и уменьшается эффективность:

где Vd − мертвый объем; K − коэффициент распределения; Vж − объем жидкой фазы.

Природа газа-носителя. В газовой хроматографии при небольших давлениях инертные газы-носители практически не адсорбируются, особенно в газожидкостной хроматографии. Поэтому природа газа-носителя практически не влияет на селективность разделения, за исключением некоторых случаев в газоадсорбционной хроматографии при разделении газов на активных тонкопористых адсорбентах.

Природа газа-носителя влияет на эффективность колонок особенно при высоких скоростях. Сопротивление колонки, перепад давления в ней определяется вязкостью газа-носителя.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Давление газа-носителя. В большинстве случаев на входе в колонку используют избыточное давление в пределах от 0,1 до 2 атм (в очень редких случаях выше). Изменение давления в этих пределах практически не влияет ни на селективность, ни на эффективность разделения. В ряде работ применялись пониженные давления на выходе из колонки, т.е. вакуумная хроматография для разделения малолетучих высококипящих соединений. Описаны варианты газовой хроматографии при повышенных давлениях. При повышении давления возрастает сорбция газа-носителя и уменьшается сорбция разделяемых соединений, особенно если в качестве подвижной фазы используются пары жидкостей, в частности воды. Парофазная хроматография расширяет аналитические возможности газовой хроматографии.

Размер пробы. Размер введенной пробы анализируемой смеси должен быть таким, чтобы не вызывать перегрузку колонки. При введении пробы больше максимально допустимой изменяются времена удерживания. Особенно важно не перегружать капиллярную колонку, так как ее эффективность сильно падает с перегрузкой.

Способ дозирования. Пробу можно ввести быстро, в виде узкой полосы или медленно, в виде разбавленной полосы. Первый способ введения− «м е- тод поршня»− идеальный, второй − «способ экспоненциального разбавл е- ния» может приводить к дополнительному размыванию полосы. Способ дозирования в реальных случаях занимает промежуточное состояние между этими крайними случаями. В общем случае ширина дозируемой пробы должна быть значительно меньше ширины полосы вещества, получаемого на выходе из колонки.

Чувствительность, линейность, инерционность и стабильность де-

тектора. Назначение детектора − регистрация выходных кривых в виде сигналов (пиков) достаточной амплитуды, необходимых для количественных измерений. Для точных количественных измерений необходимо:

–чтобы детектор не искажал истинную форму полосы, образующейся на слое сорбента, другими словами, детектор должен быть малоинерционен, постоянная времени – небольшой;

–показания детектора были пропорциональны концентрации или количеству дозируемых веществ, т.е. детектор должен обладать достаточно широкой областью линейности;

–запись сигнала была устойчивой, не должно быть флуктуации нулевой линии или же монотонного смещения нулевой линии в течение длительного времени (дрейфа нулевой линии).

Аппаратура для газовой хроматографии

Функциональная схема газового хроматографа. В аналитических хро-

матографах используют проявительный вариант хроматографии, в этом случае газ-носитель непрерывно продувается через хроматографическую колонку. Расход газа-носителя создается за счет перепада давления на входе и выходе колонки.

Для создания перепада давления через колонку хроматограф подсоединяют к источнику со сжатым газом (баллонная или лабораторная линия со

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

сжатым газом). Через колонку поток газа-носителя должен проходить с постоянной и определенной скоростью, поэтому на входе в колонку на линии газа-носителя устанавливают регулятор и стабилизатор расхода газаносителя и измеритель расхода газа. Если газ-носитель загрязнен нежелательными примесями, то в этом случае устанавливается еще фильтр. Таким образом, на входе в колонку подключается ряд устройств, часто объединяемых в один блок (блок подготовки газа), назначение которого− установка, стабилизация, измерение и очистка потока газа-носителя. В современных хроматографах используются БПГ с электронным заданием и управлением расходов газов. Перед входом в колонку устанавливается устройство для ввода анализируемой пробы в колонку− дозатор-испаритель. Обычно анализируемую пробу вводят микрошприцем через самозатекающее термостойкое резиновое уплотнение в дозаторе, газовые пробы вводят дозирующим шестиходовым краном.

Анализируемая проба, введенная в дозатор, захватывается потоком га- за-носителя (если анализируемая проба− жидкость, то она предварительно переходит в дозаторе-испарителе в парообразное состояние) и направляется в хроматографическую колонку. За счет различной сорбируемости компоненты смеси будут с разной скоростью продвигаться по колонке. Вещества, которые сорбируются слабо, будут продвигаться по колонке с большей скоростью и выходить первыми. Сильносорбируемые вещества будут продвигаться по колонке медленнее. Если выбран достаточно селективный сорбент и подобраны оптимальные условия, то на выходе колонки компоненты смеси будут полностью разделены. Детектор регистрирует присутствие разделенных компонентов в газе-носителе. Эти сигналы в случае необходимости усиливаются (усилитель) и регистрируются на шкале вторичного самопишущего прибора или дисплея ПЭВМ в виде выходных кривых (или пиков). Для обеспечения стабильного режима работы детектора используется блок питания детектора. Сорбируемость веществ зависит от температуры. Для исключения влияния колебания температуры на результаты разделения, колонку помещают в специальную камеру-термостат, температура которой устанавливается и поддерживается терморегулятором. В случае необходимости температура колонки в процессе разделения может изменяться по определенной программе с помощью блока программирования температуры. Высота или площадь пика пропорциональны количеству или концентрации компонента в смеси. Площадь пика может быть измерена с помощью электронного интегратора или ПЭВМ. Значения площадей пиков могут быть отпечатаны на бумажном носителе.

Таким образом, перед хроматографическим анализом необходимо провести следующие операции на приборе:

–открыть вентиль баллона со сжатым газом и установить по манометру или специальному измерителю определенный расход газа-носителя;

–включить питание детектора;

–установить необходимую температуру в термостате колонок;

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2.Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

–включить самопишущий прибор, интегратор или ПЭВМ, после выхода прибора на устойчивый режим микрошприцем отобрать и ввести в доза- тор-испаритель анализируемую пробу.

Все дальнейшие операции проходят без участия оператора: компоненты пробы разделяются на колонке, регистрируются в детекторе, записываются на диаграммной ленте вторичного прибора, интегратор или ПЭВМ определяет площадь пика, а в случае применения ПЭВМ с принтером можно сразу получить полный протокол− хроматограмму с рас печатанной рядом таблицей концентраций разделенных компонентов.

Детекторы для газовой хроматографии. Всего для газовой хромато-

графии предложено более 60 типов детектирующих систем. По общепринятой классификации детекторы подразделяются на дифференциальные и интегральные по форме зарегистрированного сигнала. Дифференциальные детекторы измеряют мгновенное различие в концентрации вещества в потоке газаносителя. Хроматограмма, зарегистрированная таким детектором, представляет собой ряд пиков, площадь которых пропорциональна количеству разделенных соединений. Интегральные детекторы измеряют суммарные количества соединений, выходящих из колонки. Хроматограмма в этом случае ступенчатая, высота ступеней пропорциональна количеству соответствующих соединений.

В зависимости от однократной или многократной регистрации молекул анализируемых соединений, выделяют концентрационные и потоковые детекторы. В концентрационных детекторах сигнал пропорционален концентрации соединения в подвижной фазе (элюенте). Здесь имеет место многократная регистрация молекул анализируемых соединений. В потоковых (или массовых) детекторах сигнал пропорционален количеству пробы компонента, достигаемому ячейки детектора в единицу времени. В этом случае происходит только однократная регистрация.

По селективности детекторы классифицируются на универсальные, селективные и специфические. В универсальных детекторах регистрируются все компоненты смеси, выходящие из колонки, за исключением подвижной фазы. Селективные детекторы регистрируют определенные группы соединений на выходе из колонки. Специфические детекторы регистрируют только один компонент или ограниченное число компонентов с подобными химическими характеристиками.

Основные технические характеристики детекторов:

–чувствительность или предел детектирования;

–линейность (динамический диапазон);

–инерционность (постоянная времени, быстродействие);

–стабильность (уровень шума и дрейфа);

–величина эффективного объема чувствительной ячейки.

Чувствительность концентрационных детекторов Ак определяется следующим выражением: