Генетическая инженерия 16.09.14
.pdf
Схема ферментативного синтеза гена с помощью обратной транскрипции
Выделение фрагментов ДНК, содержащих нужный ген
Открытие, предопределившее возникновение генной инженерии, — обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК. Эти минихромосомы впервые были обнаружены в начале 50-х годов и получили название плазмид.
Плазмиды обладают способностью к автономной от хромосомы репликации, поэтому плазмиды содержатся в клетке в виде нескольких копий. Различаются плазмиды по генетическим детерминантам. Очень важно, что плазмиды из-за своих малых размеров могут быть выделены из клетки в неповрежденном, нативном состоянии.
2.Плазмиды
•Молекулы ДНК, найденные в бактериях
•Действуют как системы для переноса генетического материала другим бактериям, позволяя им эксрессировать перенесенные гены
•Маленькие - несколько тысяч пар оснований, кольцевые (но могут быть и линейные)
•Обычно несут один или несколько генов
•Имеют один район инициации репликации (участок ДНК определенной последовательности в геноме, в котором репликация инициируется
•Может выживать при определенной концентрации селективного антибиотика
•Примеры: pBR322, Ti plasmid, pUC19, BAC, etc.
Проф. А.К.Гапоненко |
34 |
Конструирование рекомбинантных ДНК
•Вектор – это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какоголибо гена.
вектор (vehicle) – повозка
3.Вектора
•Носители ДНК (могут переносить рДНК в клетку-хозяина)
•Внутри клеток хозяина, вектора могут реплицироваться продуцируя множество идентичных копий сегмента ДНК (клоны)
•Клетки хозяина передают рекомбинантную молекулу ДНК своему потомству
•Клонированные сегменты ДНК выделяют из клеток хозяина для очистки и анализа
•Размер вектора должен быть не большим ( <10kb), иметь инициатор репликации и способны реплицироваться в клетке хозяина
•Вектором может быть плазмида, вирусный геном или хромосома дрожжей
36
3. Вектор должен обладать следующими свойствами.
1.Способность к автономной (т.е. независимо от хромосомы реципиента) репликации в клетке реципиента.
2.Наличие сайта, в котором возможно встраивание желаемого фрагмента ДНК.
3.Наличие одного или нескольких маркерных генов, благодаря которым клетка-реципиент будет обладать новыми признаками, позволяющими отличить трансформированные клетки (т.е. содержащие рекДНК) от исходных.
4.Кроме того, чтобы чужеродный ген экспрессировался, необходимо его поместить под соответствующий промотор.
3. Вектора
•p ОБОЗНАЧЕНИЕ ПЛАЗМИД, B и R по имени создателей Bolivar и Rodriguez
•Плазмида имеет двуспиральную (ds) ДНК - ds-DNA 4361 BP (пар оснований
•Содержит район репликации и селективные гены: ampR и tetR , устойчивости к антибиотикам
•Имеет уникальные сайты рестрикции Pst I, EcoR I, Hind III, Sal I и Cla I
•Число копия на клетку высоко (20 – 30)
•Может нести вставку ДНК величиной 1-5kb
Проф. А.К.Гапоненко |
38 |
Основные этапы генных манипуляций
Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде.
1.Вектор переносит ген в клетку-хозяина (как правило,
бактерия Escherichia coli).
2.В клетке-хозяина вектора размножаются, производя многочисленные идентичные копии не только себя, но гена, который несет вектор.
3.Когда клетка-хозяин делится, копии рДНК передается по наследству.
4.После нескольких клеточных делений, образуются колонии идентичные клеткам-хозяина (клоны). Каждая ячейка в клоне содержит один или более копий рДНК
Проф. А.К.Гапоненко |
39 |
Основные этапы генных манипуляций
Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде.
Фрагмент ДНК, содержащий ген, который необходимо клонировать, вставляется в кольцевую молекулу ДНК, которая называется вектором, для получения рекомбинантных ДНК или (рДНК)
Гибридизация in vitro молекул ДНК возможно, если они будут иметь небольшие комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекул (до12 нуклеотидов). Такие комплементарные односпиральные последовательности получили название липких концов, так как две молекулы ДНК могут соединиться (слипнуться) этими концами.
Таким образом, если в пробирку поместить самые разные молекулы ДНК с одинаковыми липкими концами, то будет происходить рекомбинация, даже если вся их структура очень различается.
Рисунок Лещинской И.Б., Генетическая инженерия, 1996, Соровский образовательный журнал, №1,
Проф. А.К.Гапоненко |
40 |