3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Гепатопротективные средства не влияют на здоровую печень. Обязательным условием разработки гепатопротекторов является проведение экспериментов на моделях жирового гепатоза, острого и хронического гепатита. Перспективно изучение потенциальных гепатопротекторов в культуре гепатоцитов или их органоидов, поврежденных токсическими агентами. Гепатотоксины нарушают метаболизм, функции и структуру паренхимы печени.

1.2. Доклиническая оценка гепатопротекторов

Включает следующие 3 этапа:

1.Первичный отбор соединений.

2.Расширенное изучение специфической гепатопротективной активности и исследование механизма действия отобранных на первом этапе соединений.

3.Оценка общетоксического действия и специфических видов токсичности (мутагенные, канцерогенные, аллергогенные, иммунотоксические, гонадотоксические, эмбриотоксические, тератогенные, фетотоксические свойства) согласно приведенным в данном издании рекомендациям. При оценке мутагенных свойств гепатопротекторов-антиоксидантов следует иметь в виду возможность перехода антиоксидантного эффекта в прооксидантный, поэтому особое значение имеет широта дозового диапазона, в котором проявляется гепатопротективное и антиоксидантное действие.

2.Описание эксперимента и особенности его проведения

2.1. Первичный отбор потенциальных гепатопротекторов

На скрининговом этапе исследования критерием отбора потенциальных гепатопротекторов служит их более высокая терапевтическая эффективность, чем у эталонных средств. Необходимо определять острую токсичность: перспективны лишь вещества, относящиеся к III–IV классам.

Эталонные средства выбирают в зависимости от происхождения, химического строения и предполагаемого механизма действия нового соединения. Например, растительные гепатопротекторы изучают в сравнении с силибинином или катергеном, препараты фосфолипидов — в сравнении с эссенциале, стимуляторы метаболических процессов —

всравнении с адеметионином. Оптимальные терапевтические дозы в экспериментах на крысах и мышах при введении препаратов в желудок составляют для силибинина 100–200 мг/кг, катергена — 100–500 мг/кг, эссенциале — 60–80 мг/кг, адеметионина — 20–25 мг/кг.

Действие потенциальных гепатопротекторов по каждому тесту оценивают в 3–5 дозах (одна доза соответствует дозе эталонного препарата); при расширенном изучении гепатопротективной активности вещества вводят в ранее определенной оптимальной терапевтической дозе. В клинике гепатопротекторы чаще всего назначают внутрь, поэтому

вэксперименте их вводят животным в желудок с помощью зонда.

Скрининг гепатопротекторов включает ряд тестов, проводимых на мелких лабораторных животных с острым токсическим гепатитом или изолированных гепатоцитах, поврежденных гепатотоксинами.

2.1.1.Острый токсический гепатит

Убеспородных или линейных мышей и крыс вызывают острый гепатит введением тетрахлорметана или D-галактозамина. Тетрахлорметан в 50% растворе на оливковом масле вводят в желудок однократно в дозах 4–5 мл/кг или в течение 4–6 дней в дозах 1–1,25 мл/кг, внутрибрюшинно однократно в дозах 0,2–0,4 мл/кг, под кожу на протяжении 2–4 дней в дозе 2 мл/кг. D-галактозамин в водном растворе вводят внутрибрюшинно 1–3 дня в дозах 300–1000 мг/кг. Потенциальные гепатопротекторы вводят за 1 ч до введения гепатотоксинов. Контрольные животные получают гепатотоксины и экви-

711

объемное с потенциальными гепатопротекторами количество растворителей (вода, 1% крахмальная слизь).

Гепатит, вызванный тетрахлорметаном, характеризуется развитием колликвационного некроза, белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, локализованных преимущественно в центральной зоне почечной дольки, где максимальна активность зависимых от цитохрома P-450 монооксигеназ и преобладает продукция повреждающих метаболитов гепатотоксина. D-галактозамин, нарушающий синтез РНК и белка, вызывает острый гепатит, идентичный по морфологическим и биохимическим изменениям в печени вирусному гепатиту человека.

Исследования проводят прижизненно в динамике и после декапитации животных под эфирным наркозом через сутки после последнего введения потенциальных гепатопротекторов. Наиболее информативными тестами, доказывающими эффективность соединений, испытываемых в качестве гепатопротекторов, являются следующие:

1.Гексобарбиталовая проба на мышах (80 мг/кг внутрибрюшинно) и крысах (60 мг/кг внутрибрюшинно) позволяет по продолжительности наркоза оценить скорость метаболизма гексобарбитала (гексенал) под влиянием цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы гепатоцитов и характеризует состояние одной из приоритетных функций печени — антитоксической.

2.Проба с бромсульфалеином (БСФ) свидетельствует о состоянии экскреторной и антитоксической функций печени. Спектрофотометрически определяют содержание БСФ в крови крыс через 1, 5, 15 и 45 мин после введения красителя (1–5 мг/кг) в хвостовую вену. Вычисляют коэффициент ретенции БСФ, элиминируемого в виде конъюгатов

сцистеином и глутатионом (отношение концентрации через 45 мин к концентрации через 1 мин после внутривенного вливания).

3.Относительная масса печени (отношение массы печени в мг к массе тела в г) характеризует выраженность воспалительного процесса.

4.Определение степени жировой дистрофии печени на модели гепатита, вызванного тетрахлорметаном у мышей и крыс, дает возможность оценить терапевтическую эффективность новых гепатопротекторов в отношении одного из наиболее типичных патологических процессов в поврежденном органе. Исследование проводят гистохимически

спомощью окраски суданом III или IV срезов, приготовленных на замораживающем микротоме из фиксированных 10% нейтральным формалином кусочков печени. Для полуколичественной оценки содержания липидов используют пятибалльную шкалу:

— минимальная степень ожирения — гепатоциты с жировыми включениями находятся только на периферии дольки в области триады;

— слабая степень — гепатоциты, содержащие липиды, занимают примерно 1/4– 1/3 длины печеночных балок в перипортальной зоне;

— умеренная степень — подобные гепатоциты занимают 1/3–1/4 длины печеночных балок по периферии дольки;

— высокая степень — гепатоциты с жировыми каплями занимают 1/2–2/3 длины печеночных балок;

— максимальная степень — стеатоз распространяется на всю печеночную дольку. Гистохимический метод обнаружения липидов является более чувствительным, чем

биохимический.

2.1.2.Эксперименты на изолированных гепатоцитах

Вэкспериментах на изолированных гепатоцитах, поврежденных добавлением в культуральную среду тетрахлорметана (2–4 ммоль) или D-галактозамина (1,85–3 ммоль), оценивают жизнеспособность клеток по тестам поглощения трипанового синего (интактные гепатоциты с неповрежденной цитоплазматической мембраной не окрашиваются при кратковременной инкубации), выхода аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы в среду инкубации.

712

3. Расширенное изучение специфической гепатопротективной активности

иисследование механизма действия отобранных на первом этапе соединений

3.1. Модели острой патологии печени

Для моделирования острого гепатита на крысах применяют гепатотоксины с различными механизмами патогенного действия:

1.Гепатотоксины, преобразуемые зависимой от цитохрома Р-450 монооксигеназной системой в свободные радикалы и электрофильные интермедиаты, ковалентно связывающие биомакромолекулы центролобулярных гепатоцитов (тетрахлорметан, галотан, бромбензол, парацетамол, тетрациклин, изониазид).

2.Аллиловый спирт, окисляемый цитозольной и митохондриальной алкогольдегидрогеназой в электрофильный метаболит акролеин, повреждающий перипортальные гепатоциты вследствие дефицита в них восстановленного глутатиона.

3.4-пентеноевую кислоту, нарушающую β-окисление средне- и длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях печени и орнитиновый цикл синтеза мочевины с развитием эндогенной интоксикации и печеночной энцефалопатии.

4.Гепатотоксины, первично нарушающие синтез РНК и белка в гепатоцитах (D-галактозамин)8.

Бромбензол вводят внутрибрюшинно в дозах 0,25–0,4 мг/кг однократно; парацетамол (ацетаминофен) — в желудок в дозах 500–1000 мг/кг 1–2 дня; тетрациклин —

вжелудок в дозе 500 мг/кг на протяжении 5 дней; изониазид — в желудок в дозе 540 мг/кг 6 дней; аллиловый спирт — в желудок в дозах 0,05–0,1 мл/кг или внутрибрюшинно в дозе 0,05 мл/кг 1–2 дня, 4-пентеноевую кислоту — внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг на протяжении 7 дней. Ингаляцию галотана проводят в концентрации 0,5–1 об% в течение 2–4 ч (концентрацию кислорода во вдыхаемой смеси снижают до 10–14 об%). Применение тетрахлорметана и D-галактозамина для моделирования гепатита описано выше.

Жировой гепатоз вызывают у крыс с помощью интоксикации гидразином (в желудок 180–200 мг/кг, 1–2 дня) или этанолом (в желудок 7–10 мл/кг 40% раствора, 7 дней).

Повреждение печени для оценки гепатопротективного эффекта получают также временным (20–30 мин) пережатием печеночной артерии и воротной вены. Ишемия моделирует ситуации, возникающие при трансплантации печени, сердечно-сосудистой недостаточности и инфаркте миокарда. Влияние гепатопротекторов на процессы регенерации паренхимы печени оценивают на модели резекции ее 1/3–1/2 части.

Потенциальные гепатопротекторы вводят профилактически за 1–2 ч до поступления

ворганизм гепатотоксинов или ишемии, одновременно с гепатотоксинами или с лечебной целью на фоне сформированной патологии печени. Продолжительность профилактического применения гепатопротекторов соответствует сроку введения гепатотоксинов и дополнительно 7–10 дней, лечебного применения — 10–14 дней.

О влиянии потенциальных гепатопротекторов на состояние пораженной паренхимы печени судят по следующим тестам:

1.Гистологическое строение печени. На обзорных препаратах печени, окрашенных гематоксилином-эозином или пикрофуксином, изучают гистологическую картину, подсчитывают количество некротизированных гепатоцитов (имеющих ядра в состоянии пикноза, лизиса или безъядерных) на 2500 клеток в 40 полях зрения, морфометрически определяют размеры ядра и цитоплазмы и их соотношение.

2.Гистохимические показатели состояния печени. Нуклеиновые кислоты, белки, гликоген, липиды, активность ферментов в печени определяют согласно методикам, описанным в руководствах по гистохимии. Количественные изменения гистохимических показателей оценивают с помощью цитофотометрии в проходящем свете. Содержание

8 Возможно также использование хлорпромазина (аминазин), α-аманитина, фаллоидина, лиофилизированного экстракта бледной поганки, гелиотропина, эндотоксина E. coli и других гепатотоксинов.

713

гликогена и активность глюкозо-6-фосфатазы рационально определять также биохимическими методами.

3.Ультраструктура паренхимы печени. Исследование проводят с помощью электронной микроскопии.

4.Биохимические показатели крови, отражающие метаболизм и функции печени (рационально использовать стандартные наборы реактивов).

3.2. Активность ферментов печеночного происхождения в крови

Для дифференциальной диагностики патологических синдромов, установления эффективности и механизма действия потенциальных гепатопротективных средств достаточно исследовать активность индикаторных ферментов цитолитического синдрома (аминотрансферазы, γ-глутамилтрансферазы, лактат-, сорбит-, глутамат-, малатдегидрогеназы, альдолазы, уроканиназы, кислой фосфатазы, фосфолипазы А2 и др.); секреционных ферментов (псевдохолинэстераза) и экскреционных ферментов — маркеров холестаза (щелочная фосфатаза, лейцинаминопептидаза, 5´-нуклеотидаза и др.). Из них печеночноспецифическими ферментами являются уроканиназа, термостабильная фракция лактатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназа.

3.3.Содержание в крови белков, липидов, углеводов

Всыворотке крови определяют содержание общего белка, альбуминов, глобулинов

(α1, α2, β, γ), глюкозы, общих липидов, триглицеридов, холестерина, фосфолипидов, фракций липопротеинов различной плотности.

3.4.Участие печени в синтезе прокоагулянтов

Вкрови определяют содержание фибриногена, протромбина, тромбина и других факторов свертывания крови (VII, IX и X), вычисляют протромбиновый индекс.

3.5.Экскреторная функция печени

Вкрови измеряют ретенцию БСФ (см. раздел I), содержание общего и прямого билирубина. Вычисляют коэффициент глюкуронирования билирубина как отношение концентраций связанного с глюкуроновой кислотой (прямого) и общего билирубина. По результатам этих исследований можно судить о способности ферментов гепатоцитов катализировать реакции конъюгации, так как 80–100% билирубина связывается с глюкуроновой кислотой.

3.6. Антитоксическая функция печени

Исследования проводят на фоне интоксикации тетрахлорметаном, парацетамолом или D-галактозамином. Эти гепатотоксины наиболее глубоко повреждают антитоксическую функцию печени. Необходимо также исследовать влияние потенциальных гепатопротекторов на антитоксическую функцию печени интактных животных с целью выявления свойств индукторов или ингибиторов метаболизма ксенобиотиков.

3.6.1. Содержание РНК, белка и цитохромов

Измеряется в микросомальной фракции печени, содержащей 90–95% белка ЭПР. Анализы проводят в пределах суток после выделения микросом. Содержание цитохромов Р-450 и Р-420 определяют на двулучевом спектрофотометре по величине поглощения комплекса восстановленных гемопротеинов с окисью углерода соответственно при длинах волн 420 и 450 нм; количество цитохрома b5 регистрируют по разнице в поглощении между окисленной и восстановленной формами.

3.6.2. Стабильность цитохрома Р-450

Стабильность оценивают по интенсивности образования функционально инертного цитохрома Р-420 в процессе инкубации микросом в течение 30 мин при 37 °С. Рассчиты-

714

вают степень спонтанной тепловой инактивации цитохрома Р-450 как изменение в процентах разностей между конечным содержанием этого гемопротеина и цитохрома Р-420 по сравнению с исходной величиной, а также период полуинактивации цитохрома Р-450 (время, за которое половина его молекул превращается в цитохром Р-420).

3.6.3. Каталитическая активность микросом

Каталитическую активность микросом в реакциях метаболической трансформации оценивают с использованием различных субстратов изоферментов цитохрома Р-450 (N-деметилирование аминопирина, п-гидроксилирование анилина, ароматическое гидроксилирование фенобарбитала). Рационально также полярографическое изучение окисления гексобарбитала и аминопирина.

3.6.4. Дыхательная функция микросом

Дыхательную функцию микросом регистрируют полярографически по скорости окисления НАД•Н и НАДФ•Н.

3.6.5. Интенсивность реакций второй фазы биотрансформации

Интенсивность реакций второй фазы биотрансформации — реакций конъюгации характеризуют по активности УДФ-глюкуронилтрансферазы, а также по содержанию в крови глюкуронированного (прямого) билирубина и скорости экскреции БСФ.

3.6.6. Показатели эндогенной интоксикации

Показатели эндогенной интоксикации изучают на модели патологии печени, вызванной 4-пентеноевой кислотой; в крови определяют содержание аммиака, мочевины, свободных фенолов.

3.7. Биоэнергетика печени

Функциональное состояние митохондрий печени исследуют полярографическим методом с помощью закрытого электрода Кларка по скорости потребления кислорода в различных метаболических состояниях по Б. Чансу. Рассчитывают скорости потребления кислорода до (V4п), во время (V3) и после (V4o) цикла фосфорилирования добавленной АДФ (0,1 ммоль) при окислении эндогенных субстратов, флавинзависимого субстрата сукцината (1 и 5 ммоль) и НАД-зависимых субстратов малата и глутамата (по 3 ммоль), измеряют время фосфорилирования добавленной АДФ. Для оценки энергетического статуса митохондрий вычисляют коэффициенты сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О), стимуляции дыхания (СД=V3/V4п) и дыхательного контроля (ДК=V3/V4о). Вклад окисления эндогенного сукцината при окислении митохондриями НАД-зависимых субстратов вычленяют внесением в среду инкубации ингибитора сукцинатдегидрогеназы малоната (2 ммоль) и ингибитора аминотрансфераз аминооксиацетата (0,5 ммоль).

3.8. Желчеобразовательная функция печени

Исследование проводят на интактных животных и животных с гепатитом, вызванным тетрахлорметаном. О наличии у потенциальных гепатопротекторов холеретических свойств судят по скорости секреции желчи и концентрации в ней билирубина, холестерина и желчных кислот.

3.9.Перекисное окисление липидов (ПОЛ)

иактивность антиоксидантной системы печени

Исследование проводят вследствие важной роли, которая отводится антиоксидантному эффекту в механизме терапевтического действия гепатопротекторов. Моделями для изучения антиоксидантного влияния гепатопротекторов служит патология печени, вызванная гепатотоксинами с прооксидантными свойствами (тетрахлорметан, бромбен-

715

зол, парацетамол, галотан, аллиловый спирт и др.). В липидных экстрактах гомогенатов, микросом и митохондрий печени измеряют содержание первичных продуктов ПОЛдиеновых конъюгатов и вторичных продуктов — оснований Шиффа. Исследуют также кинетику образования малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой при стимуляции ПОЛ in vitro ионами двухвалентно железа и аскорбиновой кислотой или ферментативным путем с помощью НАДФ•Н.

Состояние антиоксидантной защиты печени оценивают по содержанию восстановленного и окисленного глутатиона, активности глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы, супероксиддисмутазы, каталазы, глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы, антирадикальной активности мембранных липидов.

3.10.Содержание фракций липидов и фосфолипидов в печени

Влипидных экстрактах гомогенатов, микросом и митохондрий печени интактных животных и животных с экспериментальной патологией, получавших потенциальные гепатопротекторы, определяют суммарное содержание липидов и количество их фракций — фосфолипидов, свободного холестерина, моно-, диацилглицеридов, свободных жирных кислот, триглицеридов, эфиров холестерина, а также суммарное содержание фосфолипидов и количество их фракций. Рациональна идентификация жирных кислот

всоставе фосфолипидов печени.

Часть перечисленных экспериментов возможно осуществлять на изолированной печени, перфузируемой средой с добавленными гепатотоксинами и гепатопротекторами.

3.11. Экспериментальный фиброз печени

Фиброз печени моделируют у крыс введением тетрахлорметана (самостоятельно или совместно с этанолом) или тиоацетамида. Тетрахлометан вводят дважды в неделю внутрибрюшинно в дозах 0,5–1 мл/кг в течение 5–10 недель, либо под кожу в дозах 0,25–2 мл/кг в течение 6–8 мес. Ускорить формирование хронического патологического процесса в печени можно потенцированием гепатотоксического эффекта тетрахлорметана с помощью этанола. По этой методике тетрахлорметан вводят в желудок по 0,1 мл/кг дважды в неделю в течение 6 недель, этанол — в виде 5% раствора в качестве питья вместо воды на протяжении всего исследования. Тиоацетамид вводят ежедневно внутрибрюшинно в дозах 50–100 мг/кг 1–2 мес. Помимо рассмотренных выше показателей в гомогенатах печени определяют содержание оксипролина и пролина во фракциях солерастворимого, кислоторастворимого и кислотонерастворимого коллагена, активность пролингидроксилазы, количество гликозаминогликанов и гликопротеинов. Большое значение имеет морфогистохимическое исследование печени, включая выявление компонентов соединительной ткани. В сыворотке крови измеряют содержание гликозаминогликанов и гликопротеинов.

3.12.Исследование гепатопротективного эффекта

вкультуре гепатоцитов

Исследования проводят на изолированных гепатоцитах (в том числе на культивируемых раздельно центролобулярных и перипортальных клетках), в среду инкубации которых помещают растворимые в воде гепатопротекторы (примерная концентрация для индивидуальных веществ составляет 0,01–1 мг/мл) и гепатотоксины (тетрахлорметан — 2–4 ммоль, парацетамол 1,75–10,4 ммоль, D-галактозамин 1,85–3,5 ммоль, тиоацетамид 1,35–5,3 ммоль, аллиловый спирт — 100–175 мкмоль, акролеин — 1,5–5 ммоль, гидразин — 8–20 ммоль). Определяют показатели жизнеспособности гепатоцитов (см. раздел 1) а также исследуют морфологию клеток, биотрансформацию в них ксенобиотиков, процессы липопероксидации, транспорт ионов. Гепатопротективное действие in vivo и in vitro могут не коррелировать.

Для оценки мембраностабилизирующего эффекта потенциальных гепатопротекторов исследуют их способность повышать резистентность эритроцитов к осмотическому и механическому повреждениям и предотвращать развитие гемолиза.

716

4. Оценка общетоксического действия и специфических видов токсичности

Исследуют влияние гепатопротекторов на основные органы и системы в условиях хронического эксперимента, а также возможные мутагенные, канцерогенные, аллергогенные, иммунотоксические, гонадотоксические, эмбриотоксические, тератогенные, фетотоксические эффекты.

Экспериментальные данные подвергают статистической обработке методами, соответствующими полученным результатам, и представляют в форме таблиц и графиков.

5. Интерпретация результатов

Объем конкретного исследования может не включать все приведенные в данных рекомендациях методы. Важно подобрать адекватные модели патологии печени, доказать более высокую, чем у эталонных средств, гепатопротективную эффективность соединений и установить основные механизмы их действия (антиоксидантный эффект, уменьшение синдромов цитолиза и холестаза, жировой дистрофии и некроза гепатоцитов).

Заключение

В настоящее время фармакологическая группа гепатопротективных средств представлена небольшим количеством препаратов. Вместе с тем потребность в защите метаболизма печени от токсических воздействий остается высокой в связи с неблагоприятной экологической обстановкой. Создание новых препаратов с гепатопротективным эффектом является актуальной задачей. Предлагаемая схема позволяет провести доклинические исследования перспективных гепатопротекторов, исключив уже на ранних этапах исследования соединения, недостаточно активные или токсичные.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. — М.: Медицина, 1990. — 384 с.

2.Арчаков А.И., Лисица А.В., Петушкова Н.А., Карузина И.И. // Клиническая медицина. — 2008. — № 2. — С. 4–8.

3.Буеверов А.О. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2002. — № 4. — С. 21–25.

4.Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Саратиков А.С. // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2000. — № 2. — С. 76–80.

5.Гришина М.А., Погребной А.А., Потемкин В.А., Зракова Т.Ю. // Химико-фармацевтический журнал. — 2005. — № 10. — С. 3–7.

6.Кондрашова М.Н. // Биохимия. — 1991. — № 3 — С. 388–405.

7.Новиков В.Е., Климкина Е.И. Гепатопротекторы. — Смоленск, 2006. – 120 с.

8.Самигулина Л.И., Лазарева Д.Н. // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2004. — № 4. — С. 77–80.

9.Силуянова С.Н., Андрианова Л.Е., Лесничук С.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2002. — № 3. — С. 50–56.

10.Чернов Н.Н., Березов Т.Т., Буробина С.С. Биохимия: Руководство к практическим занятиям. — М.: ГЭОТАР Медиа, 2009. — 240 с.

11.Чиркин А.А., Данченко Е.О. Биохимия: Учебное руководство. — М.: Медицинская литература, 2010. — 624 с.

12.Albano E. // Mol Aspects Med. — 2008. — Vol. 29, № 12. — P. 9–16.

13.Campion S., Tatis-Rios C., Augustine L. et al. // Toxicol Appl Pharmacol. — 2009. — Vol. 236, № 1. — P. 49–58.

14.Coen M., Hong Y., Clayton T. et al. // J. Proteome Res. — 2007. — Vol. 6, № 7. — P. 2711–2719.

717

ГЛАВА 45

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ПРОТИВОРВОТНОЙ АКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф. В.И. Легеза; д. м. н., проф. С.В. Чепур, к. м. н. И.С. Драчев; д. м. н. Ю.С. Турлаков; к. м. н., доц. А.Б. Селезнев

Введение

Рвота — неспецифическая защитная реакция, в основе которой лежит сложный рефлекторный акт, при котором происходит сокращение поперечнополосатых мышц брюшного пресса и диафрагмы, патологическая активация гладкомышечных образований пищевода, желудка и верхних отделов кишечника, приводящие к импульсному обратному движению химуса с его выбросом через рот (нос). Рвота возникает при целом ряде патологических состояний (отравление, инфекционные заболевания, закрытая черепномозговая травма и др.) и сама по себе может приводить к опасным для жизни и здоровья последствиям. Механизмы развития рвотной реакции к настоящему времени подробно изучены, в частности установлено, что реализация данного сложного защитного рефлекса происходит под контролем т.н. рвотного центра. По существующим представлениям координацию рвотной реакции и ряда других диспепсических проявлений (тошнота, гастростаз, ретчинг) осуществляют нервные образования продолговатого мозга, функционально взаимосвязанные с т.н. хеморецепторной триггерной зоной (ХТЗ), расположенной в нижней части дна IV желудочка. Рецепторные образования ХТЗ способны взаимодействовать с большим количеством биологически активных веществ (серотонин, гистамин, дофамин, простагландины и др.), повышение концентрации которых в крови способно вызывать развитие рвотной реакции. Рвотный центр имеет тесные структурные и функциональные взаимосвязи с дыхательным, сосудодвигательным, кашлевым и др. специализированными центрами продолговатого мозга, а также ретикулярной формации ствола головного мозга, вегетативными центрами, находящимися на различных иерархических уровнях организации вегетативной нервной системы.

По патогенетическому механизму инициирования эметической реакции можно выделить висцеральную, гематогенно-токсическую и центральную рвоту. Пусковым механизмом висцеральной рвоты являются афферентные сигналы из ЖКТ, желчных путей, брюшины, коронарных артерий, идущие по блуждающему нерву и симпатическому нервному стволу.

К центральной рвоте приводит непосредственное воздействие на рвотный центр. В качестве примера можно привести рвоту при увеличении внутричерепного давления, заболеваниях головного мозга (менингите, энцефалите, абсцессах и опухолях головного мозга), воздействии на вестибулярный аппарат, подкорковые структуры и корковые центры. В эту же группу можно включить и т.н. психогенную рвоту при истерическом неврозе (истерическая рвота), а также варианты привычной рвоты при других заболеваниях нервной системы. В значительной степени механизмы инициации рвоты сопряжены с изменением функционирования центральных и периферических дофаминергических и серотонинергических нейронов, нарушениями медиации в нейрокининовых сигнальных системах.

Гематогенно-токсическая рвота наблюдается при накоплении в крови токсических продуктов нарушенного метаболизма (при уремии, декомпенсированном сахарном

719

диабете, печеночной недостаточности, порфирии, тиреотоксикозе), циркуляции в крови экзогенных ядов (угарный газ, хлор, алкоголь и др.), лекарственных интоксикациях (препаратами наперстянки, рентгеноконтрастными средствами, цитостатиками, сульфаниламидами, препаратами железа, некоторыми наркотиками, апоморфином и др.). К этому же виду следует отнести рвоту при различных инфекционных болезнях, связанную с действием токсинов возбудителей. Механизм возникновения гематогенно-токсичной рвоты связан с активацией ХТЗ, импульсы из которой далее поступают в моторную зону рвотного центра.

Различие патогенетических механизмов возникновения рвоты обусловливает наличие множества эметических моделей на животных (апоморфиновая, радиационная, цисплатиновая и др.), применяемых для выявления у ЛС противорвотной активности и оценки эффективности противорвотных средств. Кроме того, моделирование рвоты на наиболее часто используемых в лабораторных исследованиях грызунах (мыши, крысы, кролики) невозможно в связи с отсутствием у них рвотного центра. Поэтому с учетом механизмов формирования эметического синдрома для первичной скрининговой оценки препаратов на грызунах применяются т.н. непрямые методы отбора противорвотных средств (метод Бецольд-Яриша, вкусовая аверзия и др.).

Купирование рвоты и рефлюксов пищевых масс осуществляется посредством применения прокинетиков и противорвотных средств, исследованию эффективности которых посвящены настоящие методические рекомендации.

1. Изучение противорвотной активности фармакологических веществ

Оценка противорвотной активности фармакологических средств включает в себя следующие основные этапы:

—первичный отбор;

—углубленное изучение специфической противорвотной активности;

—изучение фармакологических свойств, особенностей действия и безвредности.

1.1. Первичный отбор

Поиск противорвотных средств проводят в исследованиях на собаках при моделировании рвотной реакции введением эметических агентов — апоморфина или сульфата меди.

Апоморфиновая рвота вызывается у собак подкожным введением апоморфина гидрохлорида в дозе 0,1 мг/кг.

Рефлекторная рвота вызывается введением в желудок 2% раствора сульфата меди в объеме 0,5 мл/кг.

Эметогенные средства вводят не менее чем через 12–20 ч после кормления. Антиэметическое действие нового препарата изучается при подкожном или внутри-

мышечном введении его в дозе, составляющей 1/10 от ЛД50 для мышей, за 35–45 мин до инъекции апоморфина. Эти исследования можно проводить на одних и тех же животных многократно, но не чаще одного раза в неделю. Собаки со слабой рвотной реакцией (два–три рвотных акта в ответ на введение эметогенных средств) должны выводиться из исследования.

Первоначально каждое соединение целесообразно исследовать не менее чем на трех животных. В том случае, если рвота у получавших соединение собак не наступает, исследования повторяют, доводя объем выборки до установленного настоящим Руководством.

В процессе эксперимента регистрируют время появления каждого рвотного акта и количество рвотных актов с выбросом желудочного содержимого.

Противорвотное действие изучаемого вещества оценивают путем сравнения количества животных с наличием рвотного акта в получавшей изучаемое вещество и контрольной группах, сравнения количества рвотных актов у животных в получавших изучаемое вещество группах, сравнения латентных периодов проявления эметического синдрома.

720