3 курс / Фармакология / Диссертация_Болатчиев_А_Д_Антибиотикорезистентность_микроорганизмов

21

кодонов, может происходить трансляция белка, и образуются ретроциклины,

имеющие противомикробную активность) [57, 93].

Несмотря на генетические отличия, все дефензины человека синтезируются in vivo по схожему сценарию: сначала происходит трансляция так называемого

«большого» пре-пропептида (от англ. – pre-propeptide), который содержит около

100 аминокислотных остатков и состоит из N-концевого удлинения и пропептида.

Пропептид, в свою очередь, состоит из продомена и C-концевой зрелой последовательности самого дефензина (около 35 аминокислотных остатков).

Продомен ингибирует биологическую активность дефензина, выполняет функцию защиты клетки-продуцента и нужен для того, чтобы избежать аутотоксичности

[176]. Синтезированные α-дефензины (HNP-1-4) поступают в азурофильные гранулы, которые высвобождаются в фагоцитарные вакуоли, содержащие патогены. Более 40% из всех белков аузрофильных гранул нейтрофилов приходится на α-дефензины [79, 80]. У здоровых лиц HNP-1-4 имеют очень низкие концентрации во внеклеточной жидкости – 3,54±2,97 нг/мл [52]. При сепсисе и бактериальном менингите уровень данных антимикробных пептидов в плазме может повышаться до 0,17 мг/мл [148] – это является следствием дегрануляции нейтрофилов, их лизиса и/или утечки содержимого при формировании фагосом

[185]. В то время как HNP-1-4 в «изобилии» и постоянно экспрессируются нейтрофилами, базальная продукция других α-дефензинов – HD-5 и HD-6 –

модулируется в ответ на инфекции, передаваемые половым путем [156], либо их уровень снижается за счет активации Wnt-сигнального пути (активация транскрипционного фактора TCF4 при болезни Крона) [192]. Что касается β-

дефензинов, то hBD-1 экспрессируется постоянно во всех типах эпителиальных клеток [105], а синтез hBD-2 и hBD-3 индуцируется в ответ на инфекционные стимулы (от бактерий, грибов и вирусов) и на провоспалительные цитокины

(интерлейкин-1β и фактор некроза опухоли-α) [175]. Также было показано, что ретиноевая кислота может полностью подавлять синтез β-дефензинов в кератиноцитах за счет ингибирования транскрипционного фактора AP-1 – эти

22

данные демонстрируют, что баланс между метаболитами витамина А и провоспалительными цитокинами может иметь большое значение в регуляции экспрессии данного класса антимикробных пептидов [87]. Уровень hBD-1 в крови у здоровых лиц составляет 8,85 нг/мл (от 7,46 до 9,69 нг/мл) [98].

Дефензины являются модуляторами воспаления и активаторами адаптивного иммунного ответа. Данные антимикробные пептиды напрямую стимулируют миграцию иммунных клеток, способствуют высвобождению провоспалительных цитокинов и активируют антигенпрезентирующие клетки в направлении Th1-

иммунного ответа – тем самым дефензины являются эффективным связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом [34, 176]. Кроме CCR6-

опосредованного хемотаксического эффекта в отношении дендритных клеток, β-

дефензины обеспечивают миграцию моноцитов/макрофагов, причём hBD-2- и hBD-3-зависимый хемотаксис опосредован CCR2-рецепторами [163]. α-дефензины in vitro также демонстрируют себя как хемокины – в присутствии HNP-1, HNP-3 и HD-5 усиливалась миграция макрофагов, Т-лимфоцитов и незрелых тучных клеток

[83]. β-дефензины, помимо хемотаксического эффекта в отношении антигенпрезентирующих клеток, способны также напрямую индуцировать активацию данных клеток путем усиления экспрессии HLA-комплексов и костимулирующих молекул – CD80 и CD86; а hBD-3 активирует дендритные клетки и моноциты путем стимуляции TLR1/2-MyD88-сигнального пути, без участия рецепторов CCR6 и CCR2 [77]. Исследования in vitro и in vivo показывают,

что α- и β-дефензины могут действовать как провоспалительные молекулы – помимо мобилизации дендритных клеток и макрофагов, данные пептиды вызывают секрецию цитокинов клетками воспаления. К примеру, hBD-1-3

вызывают массивный выброс интерлейкина-6, интерлейкина-8 и CCL2 (сокр. от англ. С-С motif ligand 2, является мощным фактором хемотаксиса моноцитов) [49],

а HD-5, стимулируя эпителий кишечника, приводит к высвобождению провоспалительных молекул: интерлейкина-2, интерлейкина-8, фактора некроза опухоли-α, CCL20 (фактор хемотаксиса лимфоцитов и нейтрофилов); кроме того,

23

данный дефензин обладает проапоптотическим действием на эпителиальные клетки кишечника и CD4+ T-лимфоциты [124]. Говоря об иммуномодулирующих свойствах дефензинов, следует отметить, что в исследованиях in vitro HNP-1 и hBD-2 в концентрации 10 мкг/мл способны активировать систему комплемента,

взаимодействуя с фактором C1q [31]. В мышиной модели колита (колит,

индуцированный декстраном сульфата натрия) введение HNP-1 приводило к инфильтрации кишечника макрофагами и лимфоцитами. Более того, в культуре клеток толстой кишки, полученной от этих мышей, были выявлены высокие уровни

γ-интерферона, фактора некроза опухоли-α и интерлейкина 1β [53].

Иммуностимулирующие свойства дефензинов могут быть использованы для получения вакцин. Так, Ворожцова Е.В. и коллеги продемонстрировали, что дефензин-2β запускает синтез антител в ответ на введенную ДНК-вакцину,

кодирующую антиген Gag вируса иммунодефицита человека, данные результаты позволяют получать иммуноглобулины к ДНК-вакцинам, а также к гипотетическим белкам (существование которых предполагается по данным транскриптомного анализа) [14].

Так как наружная поверхность всех бактерий имеет отрицательный заряд (за счет присутствия липополисахаридов и/или тейхоевых кислот), положительно заряженные и гидрофобные антимикробные пептиды (в частности, α- и β-

дефензины) неспецифически «накапливаются» на поверхности как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. На протяжении многих лет считалось, что антибактериальная активность дефензинов связана лишь с пермеабилизацией (повышение проницаемости мембран клеток) – дефензины,

словно таран, пробивают стенку бактерий, что приводит к лизису и гибели микробов [147]. Однако в последнее время для некоторых дефензинов были обнаружены и альтернативные механизмы противомикробного действия [18, 24]:

1.Модель «бочка-посох», при которой AMPs формируют димеры или мультимеры и пересекают мембрану бактерий, образуя в ней бочкообразные (циллиндрические) поры [130].

24

2.Образование тороидальных пор – при данной модели катионные пептиды соединяют наружный и внутренний слои липидов мембраны, формируя монослой, ведущий к образованию пор [136].

3.Модель «ковра»: AMPs располагаются параллельно наружной поверхности микробных клеток и при достижении пороговой концентрации образуются мицеллы, после чего липидная мембрана разрушается [145].

4.«Погружающиеся плоты» и электропорация – модель, при которой AMPs

могут связываться с мембраной и погружаться в ее структуру либо создавать электрический потенциал, достаточный для образования пор

[55, 61].

Среди антимикробных пептидов наибольший практический интерес представляют HNP-1 и hBD-1 [147], что обусловлено их широким спектром противомикробной активности и разнообразием биологических эффектов.

HNP-1 (α-дефензин-1), по данным APD, состоит из 30 аминокислотных остатков: ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC. α-дефензин-1 является катионным пептидом и обладает антибактериальной, противовирусной,

фунгицидной и антипаразитарной активностью [147]. Разнообразный спектр противомикробной активности данного дефензина представлен в таблице 1.

25

Таблица 1 – Спектр противомикробной активности HNP-1 [147]

Следует отметить, что, по данным APD, минимальная подавляющая концентрация (МПК) HNP-1 в отношении S. aureus составляет 0,5 – 2,5 мкг/мл.

Помимо пермеабилизации мембраны, в отношении стафилококков было показано,

что данный антимикробный пептид способен ингибировать липид II, являющийся предшественником в синтезе клеточной стенки [117]. Кроме того, в исследовании in vivo было показано, что α-дефензин-1 обладает способностью нейтрализовать летальный токсин возбудителя сибирской язвы – через пять суток после инфицирования выживаемость в группе получавшей HNP-1 составила 100% [101].

Помимо способности инактивировать летальный токсин (путем димеризации),

также было показано, что данный дефензин защищает макрофаги от гибели,

индуцированной эндоспорами Bacillus anthracis и непосредственно подавляет образование этой формы существования возбудителя сибирской язвы [72]. Одним из серьезных осложнений после использования АБП является возникновение псевдомембранозного колита, вызванного Clostridium difficile. Для лечения данного заболевания в арсенале врачей имеется лишь два противомикробных препарата – метронидазол и ванкомицин [25]. Учитывая широкий антимикробный спектр

26

действия HNP-1, а также то, что другой α-дефензин – HD-5 – продуцируется слизистой оболочкой кишечника, было проведено исследование, которое показало,

что оба дефензина в диапазоне концентраций 0,3-7 микромоль эффективно убивают даже гипервирулентные штаммы C. difficile. Аналогичные результаты были получены в отношении кишечной палочки и энтерококков (Enterococcus faecalis). Данные дефензины вызывали деполяризацию и фрагментацию мембраны всех трех микроорганизмов. Полученные данные могут быть использованы в клинической практике для лечения и профилактики данных инфекций; также предполагается, что HD-5, экспрессируясь в слизистой оболочке тонкого кишечника, играет роль сдерживающего фактора в развитии C. difficile-

ассоциированной инфекции [78]. Проводятся интересные исследования по изучению противотуберкулезной активности дефензинов: in vitro было показано,

что HNP-1 активен в отношении Mycobacterium tuberculosis (МПК имела диапазон от 2,5 до 25 мкг/мл) [64]. В экспериментальной модели туберкулеза совместное применение HNP-1, изониазида и рифампицина демонстрирует синергизм действия – использование противотуберкулезных средств без α-дефензина-1 менее эффективно, чем в комбинации с данным пептидом [97]. Говоря о перспективах применения HNP-1 в качестве противотуберкулезного препарата, следует учитывать, что его высокая активность в отношении M. tuberculosis обусловлена не только непосредственным киллингом микобактерий, но и высокой иммуномодуляторной активностью (например, хемотаксисом T-клеток и моноцитов в очаг воспаления) [97].

Что касается противовирусной активности α-дефензина-1, то обращает на себя внимание разнообразие спектра (Таблица 1) и механизма противовирусного действия – HNP-1 способен действовать на различные стадии жизненного цикла вирусов. К примеру, данный пептид способен инактивировать вирус простого герпеса первого типа за счет связывания с вирусной оболочкой (суперкапсидом)

[59]. Также было показано, что HNP-1 связывается с вирусной оболочкой вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), однако приводит ли это к повреждению

27

вирусных частиц, до сих пор не установлено; в том же исследовании было продемонстрировано, что α-дефензин-1 останавливает репликацию вируса за счет ингибирования связывания ВИЧ-1 с рецепторами CCR5 и СXCR4 (причем противовирусная активность HNP-1 наблюдается как до добавления вируса в клеточную линию, так и через 12 часов после инфицирования); более того, данный пептид in vitro снижает экспрессию рецептора СXCR4 – таким образом, в

физиологических концентрациях HNP-1 обладает антиретровирусной активностью, влияя на различные звенья инфекционного процесса [170]. Нельзя не отметить, что этот антимикробный пептид обладает способностью связывать антигены ВИЧ – gp41 и gp120, а также клеточный рецептор CD4, тем самым блокируя способность вируса проникать в клетки [196]. Очевидно, что дефензины играют важную роль в противовирусном иммунитете, что подтверждается различными исследованиями: у пациентов, инфицированных ВИЧ, уровень α-

дефензинов, продуцируемых миелоидными дендритными клетками, достоверно выше, чем у здоровых лиц; также уровень данных дефензинов имеет положительную корреляцию с уровнем CD4+Т-клеток – таким образом, чем выше уровень пептидов HNP-1-3, тем медленнее прогрессирует ВИЧ-инфекция [162]. В

другом исследовании изучались концентрации α- и β-дефензинов в крови при вирусном гепатите C – было показано, что при данной инфекции уровень антимикробных пептидов превышает нормальные значения в 2-105 раз:

концентрация α-дефензинов была в диапазоне от 31,2 до 1398 нг/50 мкл (у здоровых лиц – 13.5±1,5 нг/50 мкл), а уровень β-дефензинов плазмы определялся в диапазоне

44,50-1056,11 нг/50 мкл (в контрольной группе – 2,88±0,14 нг/50 мкл) [131].

Обращает на себя внимание и фунгицидная активность HNP-1, действующего на

Candida spp. – в данном случае механизм противомикробного действия связан с влиянием на энергетический метаболизм – α-дефензин-1 истощает внутриклеточный аденозинтрифосфат и увеличивает внеклеточную концентрацию данной молекулы, что приводит к гибели грибов [67].

28

Обращает на себя внимание и противоопухолевая активность α-дефензина-1,

при использовании которого в модели рака груди у мышей (линия 4Т1) было показано уменьшение размеров опухоли и ее метастазирования. Кроме того, HNP- 1 увеличивал чувствительность опухоли к доксорубицину, что потенциально может быть использовано в клинической практике для увеличения эффективности химиотерапии [189].

Другой представитель дефензинов – β-дефензин-1 (hBD-1) – состоит из 36

аминокислотных остатков и имеет следующую аминокислотную последовательность: DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK

(сведения из базы данных APD). Спектр противомикробного действия данного антимикробного пептида представлен в таблице 2.

Таблица 2 – Спектр противомикробной активности hBD-1 [147]

β-дефензин-1 является барьером, защищающим эпителиальные клетки от инфицирования; его противомикробная активность немного слабее, чем у других

β-дефензинов, однако при разрушении дисульфидных мостиков бактерицидная активность hBD-1 возрастает – редукция дисульфидных связей in vivo

обеспечивается за счет действия тиоредоксинов (оксидоредуктаз, присутствующих на эпителиальных оболочках) [169]. Также было показано, что данный дефензин способен стимулировать нейтрофилы к выбросу внеклеточных ловушек, которые

«захватывают» S. aureus; причем данный защитный механизм срабатывает благодаря стимулам от стафилококкового токсина [108]. Секреция β-дефензинов hBD-1-3 возрастает при бронхолегочных инфекциях – исследования in vitro

показывают, что при инфицировании клеток альвеолярного эпителия (клеточная линия A549) возбудителями туляремии (Francisella spp.) hBD-1 и hBD-2 проявляют

29

высокую антибактериальную активность [72]. Большой интерес представляет противомикробное действие hBD-1 в отношении Salmonella spp., в особенности активность против возбудителей брюшного тифа (Salmonella enterica серовар

Typhi) – Maiti и коллегами было продемонстрировано, что β-дефензин-1 убивает бактерии (следует подчеркнуть, что кроме сальмонелл в данном исследовании изучали антибактериальную активность и в отношении MRSA и кишечной палочки), начиная с концентрации 0,1 мкг/мкл (максимальный эффект in vitro

достигался при увеличении концентрации hBD-1 до 0,6 мкг/мл и при комбинации с hBD-2) – полулетальная доза hBD-1 (уничтожение 50% бактерий) in vitro

составила 0,38, 0,36 и 0,66 мкг/мл соответственно для S. Typhi, E. coli, и S. aureus

(MRSA); более того, в экспериментальной модели брюшного тифа на мышах выживаемость животных, получавших hBD-1, была достоверно выше, чем в контрольной группе, через 110 часов после инфицирования в контрольной группе летальность составила 100%, а в опытной группе (100 мкг β-дефензина-1) погибло лишь 25% животных [125]. Механизм противовирусной активности hBD-1 основан на блокировании проникновения вирусов в клетки макроорганизма [65], а

противогрибковая активность достигается путем пермеабилизации мембраны

[109]; причем минимальная фунгицидная концентрация в отношении Candida albicans составляет 7 микромоль.

Однако, несмотря на большое количество известных биологических свойств,

на сегодняшний день недостаточно сведений о механизме бактерицидного действия дефензинов. В этой связи представляется перспективным поиск новых мишеней, с которыми могли бы взаимодействовать антимикробные пептиды.

Одной из вероятных мишеней является пептидогликан, являющийся важнейшим компонентом клеточной стенки бактерий [35]. Для проверки данной гипотезы отлично подходят методы компьютерного моделирования лиганд-белковых комплексов (или так называемые алгоритмы докинга), которые находят применение при разработке новых лекарственных препаратов. Молекулярный докинг может применяться для моделирования взаимодействия между двумя молекулами на атомном уровне, что позволяет характеризовать поведение

30

исследуемых веществ в сайтах их связывания между собой, а также исследовать фундаментальные биохимические процессы [133].

Более того, взаимодействие дефензинов с бактериями, в частности – с

пептидогликаном, должно приводить к изменениям клеточной поверхности, что может быть оценено с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ),

представляющей собой уникальный способ визуализации биологических объектов.

Данный метод исследования позволяет провести высокоточное исследование морфометрических параметров микроорганизмов, досконально анализировать взаимодействие молекул с поверхностью микроорганизмов, изучать физико-

химические свойства, измерять ригидность и исследовать адгезивные свойства поверхности бактерий [140]. Более того, АСМ дает возможность получить трехмерные изображения различных биологических объектов [46]. Первый атомно-силовой микроскоп был разработан Бинингом и коллегами в 1986 году [46].

Техника получения изображений, лежащая в основе работы атомно-силовых микроскопов, не похожа на обычные микроскопы, которые формируют изображения, захватывая свет или электроны с поверхностей. Основной принцип АСМ заключается в силовом взаимодействии между зондом и поверхностью.

Датчики, представляющие собой упругую консоль (кантилевер) с острым зондом на конце, регистрируют это силовое взаимодействие; сила, действующая со стороны поверхности на зонд, приводит к возникновению изгиба кантилевера;

регистрация величины этого изгиба позволяет точно контролировать силу взаимодействия зонда с поверхностью. Принцип работы атомно-силового микроскопа схематично представлен на рисунке 2.

АСМ позволяет получать высокое пространственное разрешение объектов,

находящихся в привычных для них условиях, что особенно важно при исследовании микроорганизмов [23].