5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Бронхиальная_астма_и_хроническая_обструктивная

Защита ферментов и белков, в частности липопротеинов, присутствующих в плазме крови, осуществляется внеклеточной АОС. Эта антиоксидантная система, как и клеточная, характеризуется наличием антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных биоантиоксидантов и присутствует не только в плазме крови, но и в межклеточной, спинномозговой, синовиальной жидкостях и лимфе.

Классификация по каталитической активности антиоксидантов.

Наиболее распространенной классификацией на сегодняшний день является деление системы детоксикации АФК на основании каталитической активности АО, то есть на ферментные и неферментные

[34].

АНТИОКСИДАНТЫ

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ КЛЕТОЧНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАН

Рис.7. Классификация антиоксидантов по локализации, относительно мембраны

Классификация по молекулярным массам антиоксидантов [78].

Первая группа – высокомолекулярные соединения: ферменты антиоксидантной защиты, а также белки, способные связывать ионы Fe2+ и

30

Cu2+, которые являются катализаторами свободнорадикальных процессов (супероксиддисмутаза, церулоплазмин, каталаза, глутатион-зависимые ферменты, альбумины, ферритины, лактоферрин, металлотионеины и т.п.).

Вторая группа – низкомолекулярные АО.

Существует классификация, объединяющая классификации АО по каталитической активности и по молекулярным массам (рис.8.):

1. Ферментные антиоксиданты (высокомолекулярные) АО:

три изоформы супероксиддисмутаз [91, 145]; каталаза, пероксидазы, редокс-система глутатиона (глутатионовая пероксидаза и глутатион-S- трансфераза); триоредоксин цитозольный и митохондриальный [91, 138, 229, 242].

ФЕРМЕНТНЫЕ

Супероксиддисмутаза в трех изоформах

АКаталаза

ИТриоредоксин цитозольный и митохондриальный

ТФлавоноиды

Стероидные гормоны, Ы Женские половые гормоны

Низкомолекулярные SHсоединения

Рис.8. Классификации антиоксидантов по каталитической активности и молекулярной массе

Ферментные антиоксиданты – ферменты антиоксидантной защиты, а также белки, способные связывать ионы Fe2+ и Cu2+, являющиеся

31

катализаторами свободнорадикальных процессов, обеспечивающие комплексную антирадикальную защиту биополимеров. Для ферментных АО характерна высокая специфичность, строго определенная органная и клеточная локализация, а также использование в качестве катализаторов металлов Cu, Fe, Mn, Zn, Se [46].

Ферментные антиоксиданты обладают значительным преимуществом перед антиоксидантами неферментной природы за счѐт большей нейтрализующей мощности, способности к регенерации и субстратной индукции [74].

Супероксиддисмутаза и каталаза – важнейшие компоненты антиокислительной системы всех клеток организма.

Супероксиддисмутаза (СОД) – основной внутриклеточный антиоксидант, широко представленный во всех органах и тканях.

Основная функция СОД заключается в дисмутации супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода [178], которая затем удаляется благодаря активности каталазы и оксидаз [145], в первую очередь глутатионпероксидаз [8]. Предотвращая избыточное образование супероксид аниона и перекиси водорода, данные ферменты, таким образом, предотвращают цепную реакцию, приводящую к образованию высокоактивных вторичных радикалов [249].

СОД представляет собой группу металлопротеинов и существует в виде трех изоформ: марганец содержащая СОД (Mn-СОД), локализована в митохондриях; медь-цинк содержащая СОДК (CuZn-СОД), содержится в цитозоле клеток (в т.ч. и в эритроцитах) и экстрацеллюлярная SOD (ЕССОД), которая также содержит цинк и медь и локализована на поверхности эндотелиальных клеток в экстрацеллюлярном пространстве, а также присутствует в плазме, синовиальной жидкости, моче, бронхиальном и пищеварительном секретах [91, 145, 178].

Внеклеточная супероксиддисмутаза (EC-СОД) является первичным внеклеточным ферментом антиоксиданта в легком и наиболее высоко выражена в дыхательных путях и сосудистых стенках. Ее активность максимальна в легких, щитовидной и поджелудочной железе.

Каталаза (КАТ) также относится к ферментативным антиоксидантам и представлена в пероксисомах и цитозоле клеток (в частности эритроцитов), участвует в детоксикации нерадикальной активной формы кислорода – Н2О2, образуемой при анаэробном окислении флавопротеидов [8]. Способность КАТ инактивировать АФК и липидные радикалы гораздо меньше, чем у СОД и глутатионпероксидазы (GPx). Однако вместе с СОД и GPx она образует главный пул внутриклеточных антиоксидантов, направленных против действия оксидативного стресса

[145].

По химическому составу КАТ является гемопротеином и состоит из 4-х идентичных субъединиц, каждая из которых в качестве простетической

32

группы содержит гемм с трѐхвалентным железом.

Каталаза является высокоактивным ферментом, не требующим энергии для активации. Снижение активности КAT возникает при избытке метионина, цистина, меди, цинка. Инактивация перекиси водорода возможна и при участии пероксидаз, обнаруживаемых в печени, почках, нейтрофильных лейкоцитах [41].

Редокс-система глутатиона. Самым распространенным соединением в тканях, содержащим значительное количество сульфгидрильных групп, является глутатион (гамма-глютамил- цистеинглицин). Глутатион обеспечивает инактивацию перекиси водорода и гидроперекисей липидов, служит коферментом при восстановлении в нижних дыхательных путях метгемоглобина, нейтрализует озон и NO· [26, 41].

Глютатион выполняет важную роль в поддержании внутриклеточного равновесия окислительно-восстановительного потенциала и является одним из главных детоксифицирующих антиоксидантов практически во всех клетках организма [123, 228, 229]. Глютатион определяет внутриклеточный цикл окислительновосстановительного потенциала и детоксицирует АФК.

Глютатионовое участие в физиологии клеточного метаболизма отражает важность этой молекулы во внутриклеточных функциях. Вопервых, глутатион вовлечен в детоксикацию реактивных пероксидов (ROOH), таким образом, действуя как антиоксидант. Во-вторых, глутатион участвует в сохранении внутриклеточной белковой целостности, таким образом, действуя как важный регулятор клеточного сульфгидрильного статуса и равновесия окислительно-восстановительного потенциала. В- третьих, глутатион управляет сигнальными проводящими путями. В- четвертых, глутатион регулирует экспрессию и активацию чувствительных к окислительно-восстановительному потенциалу факторов транскрипции [96, 138, 151]. Также, связанный глутатионом метаболизм является критическим для того, чтобы обеспечить внутреннюю поверхность равновесия между оксидантным стрессом и адаптивными реакциями [149, 229].

В организме присутствует окисленная (GSSG: около 3% от общего количества) и восстановленная (GSH) формы глутатиона, антиоксидантное действие которого объясняется его функцией как субстрата для глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы (GТ) [22, 53].

Антиоксидантная и антирадикальная защита клеток обеспечивается глутатионпероксидазой – селенсодержащим ферментом, инактивирующим гидроперекиси жирных кислот, перекиси белкового и нуклеинового происхождения и другие органические гидроперекиси [146]. Активность глутатионпероксидазы усиливается витаминами группы С и А, которые способствуют усвоению селена, его транспорту и утилизации. GPx в

33

нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их конъюгации с восстановленным глутатионом.

Глутатионредуктаза (GR) – широко распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную концентрацию восстановленной формы глутатиона.

Во многих реакциях, катализируемых GPx и глутатион-S- трансферата (GSТ), отдавая протоны, две молекулы GSH соединяются дисульфидной связью и образуют, так GSSG. Для восстановления GSSG и, следовательно, рециклирования GSH, в клетках существует специальный фермент – GR [38] .

Для восстановления окисленного глутатиона глутатионредуктазой в качестве доноров водорода используется НAДФH, который образуется в пентозофосфатном пути в ходе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции

[19].

GPx также является основным внутриклеточным ферментом, инактивирующим гидроперекиси жирных кислот, перекиси белкового и нуклеинового происхождения и другие органические гидроперекиси [145]. Разрушая гидроперекиси липидов, GPx регулирует тем самым продукцию арахидоновой кислоты и уменьшает воспаление.

2.Неферментные антиоксиданты:

2.1. Неферментные высокомолекулярные АО – белок-переносчик железа – трансферрин и другие белки сыворотки, способные связывать ионы железа – церулоплазмин, гаптоглобин, гемопексин [153, 156].

К высокомолекулярным внеклеточным плазменным металлсодержащим антиоксидантам неферментного действия можно отнести трансферрин, церулоплазмин и альбумин [110], которые также являются важнейшими антиоксидантами в легочной ткани [110] и в крови.

По мнению В. Halliwell et al. [152] удаление О2˙ˉ и Н2О2

антиоксидантами – СОД, КAT и GPx, вносит небольшой вклад в антиоксидантную активность внеклеточных жидкостей. Авторы считают, что главными защитными системами в плазме являются антиоксидантные белки, связывающие ионы металлов переменной валентности в формы, которые не могут стимулировать свободнорадикальные реакции, либо другим способом, препятствующим ионам металлов принимать участие в таких реакциях.

Трансферрин (ТФ) – это основной железотранспортный белок плазмы крови, который обеспечивает железом клетки и ткани и является

34

участником синтеза железосодержащих белков, в особенности гемоглобина. Кроме важнейшей его функции в качестве белка-переносчика железа, он также выступает регулятором ПОЛ. ТФ может выступать как антиоксидант, так и прооксидант. Антиоксидантные свойства ТФ обусловлены его способностью связывать ионы трехвалентного железа. Кроме того, при оксидативном стрессе, нарушается его связывание с металлами, что нарушает перемещение ионов железа и усугубляет оксидативные реакции.

Церулоплазмин (ЦП) – металлогликопротеин 2 – глобулиновой фракции, относится к семейству голубых оксидаз. ЦП – важнейший белок сыворотки крови с большой молекулярной массой, представленный одной полипептидной цепью, но имеющий несколько изоформ и характеризующийся сложной картиной распределения в тканях, а также разнообразием кооперативных форм участия в метаболизме меди и железа в организме [47]. ЦП связывает более 95% общего количества меди, содержащейся в сыворотке крови. Известно, что церулоплазмин, обладающий ферроксидазной активностью, ингибирует Fe2+-зависимое ПОЛ и образование ОН• из Н2О2. ЦП считается основным антиоксидантом плазмы крови. Поскольку ЦП неспецифически связывает Cu2+, он тормозит также Cu2+-стимулируемое образование АФК.

ЦП – это мультифункциональный белок, одна из главных его функций – медьтранспортная, реализуется при взаимодействии со специфическими рецепторами, локализованными на наружной поверхности плазматических мембран клеток. Установлено существование специфического белка-рецептора на мембранах различных клеток, в том числе и на мембранах эритроцитов человека [7]. Рецепция осуществляется путем связывания терминальных остатков сиаловых кислот эритроцитарной мембраны и остатков маннозы и ацетилглюкозамина углеводной части молекулы ЦП. Известно, что лишь 40% ЦП содержит углеводный фрагмент способный прочно связываться с рецепторами эритроцитов [59].

Синтезируется ЦП в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени. В гепатоцитах синтезируется три молекулярные формы ЦП: две из них – секретируемые (сывороточный ЦП и ЦП с молекулярной массой 200 кД), третья – внутриклеточный несекреторный ЦП-подобный белок с молекулярной массой 50 кД. Помимо печени мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота) ЦП обнаружена в коре головного мозга, мозжечке, гипоталамусе, сосудистом сплетении мозговых желудочков, кишечнике, почках, сердце, ретикулоэндотелиальной системе селезенки и бронхиолярном эпителии человека и лабораторных животных [47].

ЦП является одним из основных антиоксидантов плазмы крови. Особенностью этого белка является высокая стабильность к токсическому действию АФК, что позволяет ему сохранять биологическую активность в

35

условиях интенсивной генерации АФК [153]. Поскольку в сыворотке крови отсутствует супероксиддисмутаза, каталаза, и глутатионпероксидаза, именно церулоплазмин обеспечивает антиоксидантные свойства сыворотки крови. Антиоксидантные свойства ЦП определяются его супероксиддисмутазной, пероксидазной и ферроксидазной активностями. Кроме того, ЦП является транспортным белком, обеспечивающим клетки ионами меди.

ЦП проявляет как специфическую, так и неспецифическую антиоксидантную активность. Специфическая активность, связанная со снижением уровня активных метаболитов кислорода, может быть реализована несколькими путями. В плазме крови церулоплазмин окисляет Fe2+ до Fe3+, после чего окисленные ионы железа связываются трансферрином, транспортируются в гепатоциты и развивающиеся ретикулоциты. В результате этой реакции из сыворотки крови удаляются ионы Fe2+ – непосредственные индукторы ПОЛ. Существенно, что окисление железа ЦП, в отличие от неферментативного окисления Fe2+ в присутствие О2, не сопровождается образованием О2˙ˉ, поэтому в окислительных реакциях с участием ионов железа, ЦП оказывается антиоксидантом.

Церулоплазмин обладает способностью удалять из крови супероксидные анион-радикалы, но скорость этой реакции на два порядка ниже, чем у СОД. Однако концентрация ЦП в сыворотке крови на два порядка выше, чем концентрация СОД в тканях. Этим ЦП обеспечивает достаточно высокий уровень супероксидисмутазной активности в сыворотке крови. Он вызывает дисмутацию О2˙ˉ, которая имеет не ферментативный, а стехиометрический характер, таким образом происходит восстановление О2˙ˉ до воды, а не до перекисей, в отличие от других антиоксидантных ферментов. Со способностью перехватывать О2˙ˉ связывают ингибирующее действие ЦП на процессы ПОЛ в хиломикронах и липопротеинах [60].

Кроме того, ЦП достаточно эффективно катализирует разложение перекиси водорода и гидроксильных и липидных радикалов, заменяя, тем самым, отсутствующие в сыворотке крови каталазу и глутатионпероксидазу. ЦП является наиболее сильным, среди белков сыворотки крови, ингибитором образования гипогалоидов в системе милопероксидаза-Н2О2-Сl, способен инактивировать АФК, генерируемые миелопероксидазой, защищая 1-антипротеиназу от окислительной инактивации гипохлоритом [46].

Неспецифическая антиоксидантная активность ЦП обусловлена образованием комплексных соединений с медью [59].

2.2. Неферментные низкомолекулярные АО: убихинон, женские половые гормоны, тироксин, ферритин, лактоферрин, гемосидерин, флавоноиды, стероидные гормоны, витамины А, Е, К, низкомолекулярные

36

SH-соединения, аскорбиновая кислота, урат, билирубин [138, 229].

В качестве компонентов неферментной АОС могут выступать низкомолекулярные вещества, имеющие высокую константу скорости взаимодействия с АФК.

Основная направленность действия низкомолекулярных АО связана с защитой белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов, а также биомембран от окислительного разрушения при свободнорадикальных процессах. Важное значение низкомолекулярные АО приобретают в условиях окислительного стресса, когда ферментная АОС оказывается менее эффективной в сравнении с их протекторным действием. Причины этого – быстрая инактивация конститутивного пула ферментов СР и значительное время, необходимое для индукции их синтеза [22].

Вышеизложенный материал еще раз демонстрирует иерархичность антиоксидантной системы, указывает на многоуровневую организацию защиты. Становится очевидным, что механизмы антиоксидантной защиты представляют собой часть более общей системы поддержания химического постоянства внутренней среды организма и сама антиоксидантная система, в отличие от традиционных представлений о ней, может быть несколько шире [84].

Как любая другая систематизация накопленных знаний, классификация антиоксидантной системы позволяет выстроить определенную цепь событий, происходящих при развитии окислительного стресса и активации механизмов, противодействующих ему. На основании классификации антиоксидантной системы, как любой другой системы, выстроенной цепи последовательных или одновременных событий, хорошо видны "слабые" (не полностью исследованные) звенья, на которые следует обратить внимание. Поэтому классификация, как обобщенная и более или менее удачно систематизированная информация, призвана помогать выбирать подходы и планировать предстоящие исследования на систематизированной основе.

1.4.Методы оценки окислительно-восстановительного статуса

Для оценки свободных радикалов используются как прямые, так и непрямые методы [8].

Прямые методы

Основным прямым методом обнаружения АФК и свободных радикалов является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)

[10]. ЭПР – явление резонансного поглощения электромагнитного излучения парамагнитными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле. ЭПР используется для изучения систем, обладающих одним или несколькими неспаренными электронами: атомов, свободных радикалов в газовой, жидкой и твердой фазах, ионов переходных металлов,

37

систем в триплетном состоянии и др. Данный метод позволяет прямо обнаружить уровень СР в периферической крови и других биологических тканях организма [8].

По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить не только о присутствии непарных электронов в образце, но и определять их концентрацию, а иногда и химическую структуру радикалов, которые эти непарные электроны содержат. Метод ЭПР также позволяет оценить и состояние антиоксидантной системы крови.

Спиновые ловушки

При всех достоинствах метода ЭПР, его чувствительности в некоторых случаях оказывается недостаточно для обнаружения свободных радикалов, которые не только образуются в исследуемом образце, но и участвуют в важных процессах, в нем протекающих. Причина этого – высокая химическая активность радикалов: в биологических системах на фоне невысокой скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах отмечается высокая скорость их исчезновения, поэтому концентрации радикалов в каждый данный момент времени (так называемая стационарная концентрация) оказывается недостаточной для обнаружения методом ЭПР. Выход из положения заключается в том, что активные радикалы переводятся в неактивные, стабильные, которые регистрируются с помощью ЭПР. С этой целью к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками. Например, для "улавливания" гидроксил-радикалов HO. используют фенилбутилнитрон

(ФБН).

При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение его к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название "спинового аддукта" (от английского слова add – добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе [8].

Для улавливания других радикалов (например, супероксида) используют другие ловушки. Поскольку спиновая ловушка "перехватывает" свободные радикалы, она тормозит (ингибирует) тот процесс, который этими радикалами вызывается, например, уменьшает повреждение живых клеток радикалами, что используется в медицине.

Метод хемилюминесценции

К прямым методам изучения радикалов можно отнести также метод хемилюминесценции (ХЛ).

При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая в некоторых случаях испускается в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна

38

скорости реакции, в которой участвуют радикалы и, следовательно – их концентрации.

В 1934 г. А.Г. Гурвич обнаружил митогенетическое излучение в ультрафиолетовой области спектра, испускаемое в процессе деления растительных и животных клеток. В последующем было отмечено, что биологические объекты получают энергию для такого свечения за счет химических реакций, и это явление было названо хемилюминесценцией. В 1972 г. R. Allen et al. впервые обнаружили ХЛ в суспензии фагоцитирующих клеток – нативное свечение. Однако такое свечение является сверхслабым и для его регистрации применяются люминесцирующие соединения: люминол, люцигенин, люциферин (сенсибилизаторы свечения). После изобретения различных приборов, способных регистрировать ХЛ, этот метод стал применяться в различных областях медицинской диагностики.

Вначале он использовался в основном в целях изучения свободнорадикальной патологии (например, лучевая болезнь и авитаминоз Е). Cо временем ученые стали отмечать достоинства метода – высочайшую чувствительность, возможность непрерывной регистрации быстро изменяющихся процессов, простоту регистрирующей аппаратуры. Широкое распространение метод ХЛ получил в определении активности нейтрофилов, лимфоцитов, различных ферментов, антител в биологических средах, для оценки состояния лимфоцитов после применения модуляторов, для контроля иммунного статуса организма после трансплантаций. Общей закономерностью является увеличение спонтанной (базальной) ХЛ при всех острых воспалительных процессах. Степень увеличения ХЛ оказалась пропорциональной тяжести воспалительного процесса.

Непрямые методы

Методы исследования общей антиокислительной активности (АОА) различаются по типу источника окисления, окисляемого соединения и способа измерения окисленного соединения. Эти методы дают широкий набор результатов, которые нельзя использовать по отдельности, а результаты должны быть интерпретированы с осторожностью.

По способам регистрации проявляемой антиокислительной активности можно разделить методы на:

волюмометрические,

флуоресцентные,

фотометрические,

электрохимические,

специфические.

Обычно используется протекающая по радикальному механизму модельная реакция (чаще всего – окисления) какого-либо индивидуального

39