ладают различной чувствительностью к специальному противоопухолевому лечению. В процессе химио-, гормоно- и радиотерапии может происходить и часто происходит отбор нечувствительных к этим воздействиям клонов опухоли, которые впоследствии приводят к рецидивированию опухоли в наиболее агрессивных вариантах, неподдающихся никаким видам лечения. Генетическая гетерогенность опухолей - один из главных ограничителей для самого современного вида лечения - генотерапии. Ранее с гетерогенностью пришлось столкнуться и онкоиммунологам, применение противоопухолевых вакцин оказалось резко ограниченным антигенной гетерогенностью опухоли и ее метастазов.
Характерной чертой прогрессирующего опухолевого роста является инвазия опухоли в окружающие ткани и метастазирование. В основе этих явлений лежит повышенная продукция трансформированными клетками различного рода протеолитических ферментов, которые расщепляют межклеточный матрикс, в т.ч. и базальные мембраны эпителия. Опухолевые клетки как правило имеют слабые механические связи, межклеточные контакты, с окружающими их нормальными клетками и внеклеточным матриксом. Это происходит как за счет уменьшения количества (вплоть до полного исчезновения) некоторых видов соответствующих поверхностных рецепторов, так и за счет нарушения цитоскелета. Последнее напрямую связано с активацией некоторых онкогенов. При этом контакты клеток одного опухолевого клона между собой, как правило, сохранены. Более того, метастазирование предполагает выборочную экспрессию специальных рецепторов на поверхности трансформированных клеток, с помощью которых они могут избирательно прикрепляться к апикальной поверхности эпителия или к компонентам базальных мембран сосудов в органахмишенях.
В последнее время в понимании молекулярно-генетических основ инициации и прогрессии произошли поистине революционные сдвиги. В онкологический обиход прочно вошли понятия “онкоген” и “антионкоген”. Информация по этому разделу экспериментальной и клинической онкологии поступает лавинообразно, и нет никаких признаков уменьшения темпов текущей революции. Существует даже мнение, что период “полураспада” знаний в области молекулярной генетики составляет 6 месяцев. Т.е. стоит полгода не читать научную литературу по этой проблеме, и ваши знания устаревают ровно наполовину. Поэтому мы лишь слегка прикоснемся к молекулярной генетике канцерогенеза у человека.
Под онкогенами принято понимать гены, проявляющие трансформирующую активность в эксперименте и активирующиеся в процессе
39
канцерогенеза. Подобные генетические элементы в норме чаще всего участвуют в позитивном контроле клеточного деления. Активация онкогенов чаще всего проявляется в увеличении количества их продуктов. Это явление называется суперэкспрессией. Иными словами, трансформированная клетка может отличатся от нормальной просто повышенным содержанием совершенно нормальных белков, которые в норме тоже стимулируют деление клетки, а при трансформации эта способность лишь немного повышается, что может оказаться вполне достаточным для опухолевого роста. Это характерно для онкогенов ERBB, MYC, INT, PRAD, FOS и многих других. Вместе с тем, превращение нормального или т.н. протоонкогена в онкоген в процессе трансформации может быть и результатом мутации. При этом изменение аминокислотной последовательности онкобелка сопровождается увеличением его ферментативной активности. Классическим примером таких нарушений служат мутации в онкогенах семейства RAS.
Антионкогены, напротив, препятствуют проявлению злокачественного фенотипа в лабораторных условиях и инактивируются в опухолях. В неизмененных клетках супрессорные гены, как правило, сдерживают пролиферацию, участвуют в процессах апоптоза - запрограммированной клеточной гибели, самоубийства клеток. Повреждения в антионкогенах инактивируют эти функции. Зачастую развитие опухоли ассоциированно с прекращением экспрессии супрессорного гена. Так, ключевым моментом в патогенезе ретинобластомы является отсутствие продукта антионкогена RB-1. В других случаях уровень экспрессии антионкогена не изменен, однако, его белковый продукт оказывается неполноценным из-за нуклеотидных замен в кодирующей последовательности нормального гена (т.е. из-за точковых мутаций). Подобный механизм установлен для супрессорного гена р53.
Для большинства видов новообразований человека отмечены одни и те же молекулярно-генетические аномалии: суперэкспрессия онкогенов семейства ERBB и MYС, а также локуса INT-2; точковые мутации онкогенов семейства RAS; делеции, т.е. исчезновение антионкогенов, расположенных на хромосомах 3р, 5q, 11р, 13q, 17р, 17q, 18q и др.; нуклеотидные замены в антионкогене р53. Существует определенная органоспецифичность в характере онкоассоциированных мутаций, однако она носит достаточно умеренный характер. Наиболее изученными и часто встречающимися генетическими изменениями практически при любой опухоли у человека является точковые мутации в антионкогене р53.
40
Важно отметить, что большинство онко-ассоциированных генов пока не идентифицированно. По-видимому, в течение ближайших 10-20 лет количество известных “раковых” мутаций увеличится в 10-100 раз.
Для систематизации онко-ассоциированных мутаций, известных в настоящее время, и тех, которые будут открыты в будущем, удобно придерживаться следующей простой классификации. Все мутации можно подразделить на 2 большие группы: хромосомные и генные. Хромосомные мутации представлены как правило делениями, потерями больших участков хромосом, которые можно выявить под микроскопом в результате специального цитогенетического анализа. Вероятно, в этих “потерянных” участках локализуются прежде всего анти-онкогены или гены, имеющие отношение к процессам запрограммированной клеточной гибели (апоптозу), угнетению пролиферации и активации дифференцировки клеток.
Группа генных мутаций, обнаруживаемых методами молекулярногенетического анализа, в свою очередь делится на 2 подгруппы: зародышевые и соматические мутации. Соматические возникают в процессе взаимодействия организма с внешними канцерогенами на протяжении всей жизни по механизмам, описанным выше. Зародышевые мутации уже имеются в половых клетках и поэтому передаются по наследству. Их можно выявить у родителей при рождении ребенка, например, путем исследования клеток пуповинной крови. Это открывает широкие возможности для самого раннего прогнозирования злокачественных новообразований, а с развитием методов генотерапии - и для предупреждения рака и не только рака.
Наиболее известные зародышевые генные мутации:
BRCA -1; BRCA -2 - семейный рак молочной железы (РМЖ); RB -1 - ретинобластома;
WT -1 - нефробластома Вильмса; р53 - синдром Ли - Фраумени; APC - семейный полипоз;
NF - нейрофиброматоз 1 типа.
До тех пор, пока тонкие молекулярные, методы генотерапии рака находятся на уровне экспериментальной апробации и не нашли своего клинического воплощения, обнаружение зародышевых онкоассоциированных мутаций вынуждает врачей прибегать к старым методам борьбы с раком. Например, в случае обнаружения мутаций в генах BRCA при семейном РМЖ женщине рекомендуется родить и выкормить ребенка , а после этого сделать двухстороннюю мастэктомию с эндопротезированием. Учитывая очень высокую вероятность возникновения РМЖ (до 80-90% по данным некоторых авторов), такая радикальная мера предосторожности не кажется варварской.
41
Место и роль иммунной системы в канцерогенезе
Современная онкоиммунология базируется на 3-х главных положениях:
1.Иммунная система осуществляет надзор за генетическим постоянством внутренней среды, в т.ч. распознает и уничтожает генетически измененные и опухолевые клетки;
2.Любые внешние воздействия, угнетающие иммунную систему, приводят к ослаблению иммунного надзора и к возникновению опухоли;
3.Ускользание опухолевых клеток из-под иммунного надзора возможно вследствие недостаточной иммуногенности опухолевых антигенов или
иммуносупрессивного влияния самой опухоли.
Как следствие, все КГ факторы считаются иммунодепрессорами, признаки иммунодепрессии (или нарушения т.н. “иммунного статуса”) рассматриваются как маркеры опухолевых заболеваний, а в качестве противоопухолевых средств предлагаются любые воздействия, активирующие иммунную систему.
Между тем реальное участие иммунной системы в канцерогенезе значительно сложнее и не такое однозначное, защитное, как представляется до сих пор многим врачам, в т.ч. иммунологам и онкологам (рис. 1).
Во-первых, оказывается, что химические КГ могут вызывать синтез специфических антител (АТ) у человека в естественных условиях без ка- ких-либо адьювантов. Во-вторых, АТ к КГ встречаются у больных раком с большей частотой и взаимодействуют с КГ с большей силой, чем у здоровых людей. Эти данные получены в самое последнее время в некоторых лабораториях США, Франции, Италии и у нас, в Отделе иммунологии рака КемНЦ СО РАН. Возникают вопросы:
- так ли реально и значимо иммунодепрессивное свойство КГ, как принято считать? О какой иммунодепрессии можно говорить, если на сами КГ - низкомолекулярные, неиммуногенные соединения развивается иммунный ответ, который и в эксперименте, с помощью специальных ухищрений получить не так-то просто?
- если иммунная реакция суть защитная функция организма, то почему АТ к КГ не защищают от них человека? Почему у больных раком они встречаются чаще, чем у здоровых людей и, несмотря на их наличие, КГ все-таки оказывают присущее им патологическое действие?
Поиски ответов на эти вопросы составляют основной стержень наших научных исследований. Их результаты позволяют сделать пока
42
только предварительные, но очень важные для разработки новых средств диагностики и профилактики рака выводы.
Мы разделяем мнение некоторых американских ученых, что защитным действием обладают АТ к КГ, секретируемые в просвет желудоч- но-кишечного тракта (ЖКТ) и бронхов. Они связывают КГ окружающей среды и препятствуют их проникновению через эпителий в кровь и другие органы и тем самым ингибируют канцерогенез. Иными свойствами обладают АТ, циркулирующие в крови. Они способствуют проникновению КГ из окружающей среды через эпителий ЖКТ и бронхов и тем самым стимулитруют возникновение опухолей в этих органах.
Противоположная ситуация, по нашему мнению, складывается в таких органах, как молочная железа и предстательная железа. АТ к КГ, секретируемые в их потоки, “тянут” за собой КГ из крови через эпителий и тем самым стимулируют канцеронгенез в этих органах. Напротив, несекретируемые АТ удерживают КГ в сыворотке крови и тем самым препятствуют возникновению опухолей.
Такие представления о разно роли АТ классов G и А в канцерогенезе основаны на результатах наших научных исследований. Мы обнаружили, что у больных опухолями ЖКТ значительно чаще образуются АТ класса G, а у больных РМЖ – АТ класса А к канцерогенам группы ПАУ. На уровне плаценты происходит то же самое. АТ класса G, проникающие из крови матери в организм плода, способствуют проникновению КГ к плоду и стимулируют возникновение врожденных уродств, пороков развития и явления т.н. трансплацентарного канцерогенеза. АТ классов М и А, непроникающие через плаценту, препятствуют переносу КГ к плоду и обладают защитными свойствами.
Пока наши представления о стимулирующей, проканцерогенной функции АТ не разделяются зарубежными учеными. Но их важность очевидна. При стимуляции иммунологической реакции на КГ необходимо добиваться активации только защитного звена. Если одновременно с этим будет повышаться уровень проканцерогенных АТ, мы можем добиться противоположного эффекта - стимуляции возникновения опухоли.
То же самое можно сказать и о собственно противоопухолевом иммунитете. АТ, реагирующие с опухолевыми клетками, обнаруживаются и у здоровых людей, и у больных раком, причем у последних чаще и в больших количествах. Считается, что такие АТ экранируют опухолевые клет-
43
ки от цитотоксических лимфоцитов. Но почему они не включают механизм цитотоксичности комплемента? Мы считаем, что многое зависит от специфичности АТ, т.е. от природы опухолевого антигена. Известно, что самое главное свойство опухоли, автономность поведения, обусловлено нарушениями взаимодействий клеточных рецепторов с различными внеклеточными лигандами, регулирующими деление и дифференцировку. Мы предположили, что опухолевыми антигенами могут быть как раз такие рецепторы. Тогда АТ могут выполнять функции соответствующих лигандов или, наоборот, блокировать эти функции. В модельных экспериментах, например, показано, что АТ к рецептору инсулина могут выступать в роли агонистов или антагонистов самого инсулина.
Нам удалось обнаружить у больных раком АТ к рецептору эпидермального фактора роста, который регулирует деление эпителиальных клеток. Кроме того, мы выявили АТ, угнетающие адгезию опухолевых клеток с матриксом. Понятно, что наличие таких АТ у больных не только является признаком нарушения взаимодействия опухолевых клеток с конкретными лигандами, но и вносит дополнительный вклад в эти нарушения, т.е. способствует ускорению деления и метастазирования. Понятно также, что стимуляция синтеза таких АТ приведет к нежелательным эффектам - ускорению роста опухоли и метастазов.
Таким образом, только на примерах АТ к КГ и опухолевым антигенам видно, как неоднозначна, а порой и противоположна роль одного и того же звена иммунитета. Именно поэтому мы рекомендуем с большой осторожностью применять иммуномодулирующие средства, особенно с целью профилактики онкологических заболеваний.
В заключение следует отметить, что на ряду с АТ к КГ и опухолевым антигенам весьма вероятно появление АТ к другим структурам, участвующим в возникновении и прогрессирующем росте опухоли (рис. 1). В частности, известно, что стероидные гормоны способны оказывать генотоксическое действие на клетки, т.е. выступать в роли эндогенных КГ. Механизм этого действия аналогичен эффекту экзогенных КГ. Под действием ферментов 1 фазы биотрансформации экстрогены или андрогены превращаются в реакционно активные метаболиты, которые связываются с ДНК и вызывают мутации. Вполне очевидно, что в данном случае, а также при соединении с другими макромолекулами, гормоны становятся гаптенами. Поэтому нельзя исключить и появления соответствующих АТ. АТ к
44
гормонам, по нашему мнению вмешиваются в процессы канцерогенеза двояко. Во-первых, по аналогии с АТ к КГ они могут усиливать или угнетать транспорт гормонов в органы-мишени, модулируя их генотоксическое действие, т.е. стимулировать или тормозить канцерогенез в зависимости от класса. Во-вторых, связывая гормоны в крови, они вмешиваются
всистему обратных связей между гипоталамусом, гипофизом и органамимишенями. Это неизбежно должно модулировать межклеточную, нейроэндокринную регуляцию дифференцировки и пролиферации клеток в органах мишенях.
Еще одной разновидностью АТ, вероятно появляющихся при трансформации клеток в злокачественные, являются АТ к ферментам. Индукция их синтеза возможна при структурных изменениях ферментов вследствие мутаций соответствующих генов. АТ к внеклеточным ферментам способны ингибировать их активность. С другой стороны, сами АТ, как известно, могут выступать в роли ферментов. Такие АТ, обладающие ферментативной активностью, называются абзимами. Если структурной перестройке подвергаются протеолитические ферменты, секретируемые трансформированными клетками, то АТ к ним весьма вероятно участвуют
впроцессе метастазирования, угнетая или стимулируя его в зависимости от того, тормозят они или стимулируют активность поверхностных протеаз.
Поиск и оценка реальной патогенетической роли перечисленных типов АТ в канцерогенезе - актуальная задача не только теоретической, но и практической онкологии. На рис. 1 видно, что появление каждого из них соответствует определенной фазе канцерогенеза. Поэтому обнаружение того или иного типа АТ можно использовать как показатель активности канцерогенеза, для определения конкретного его этапа у конкретного индивидума. Техническая простота и экономичность анализа АТ делают его более предпочтительным для практики по сравнению с другими методами оценки активности канцерогенеза.
Кроме того, характеристика спектра АТ по специфичности и по классу может послужить в будущем в качестве критерия для определения показаний/противопоказаний для активной специфической иммунопрофилактики и -терапии онкологических заболеваний.
45
Лекция 4.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИОПРОФИЛАКТИКИ РАКА
Подавляющее большинство химических агентов или факторов иной природы, вызывающих канцерогенные эффекты, широко распространены в окружающей среде. В связи с этим решение проблемы уменьшения канцерогенной опасности видится в выявлении, идентификации и устранении КГ из сферы жизнедеятельности человека. Подобный подход весьма перспективен и уже дал ощутимые результаты в предупреждении опухолей некоторых локализаций. Вместе с тем, учитывая экономические и социальные аспекты проблемы, полностью исключить контакт с рядом КГ невозможно. Более того, быстрый экономический рост, с которым связывают будущее процветание таких промышленных регионов, как Кузбасс, повидимому будет обязательно сопровождаться усилением КГ нагрузки на население. Понимание этой ситуации вызывает растущий интерес к исследованиям в области направленного торможения канцерогенеза.
Поиск средств, воздействующих на процесс канцерогенеза с целью предупреждения возникновения и развития опухолей, является самостоятельным и перспективным направлением в профилактике рака. Начиная с 60-х годов, и до настоящего времени это направление интенсивно разрабатывалось на различных экспериментальных моделях не только за рубежом, но и в нашей стране. Однако сейчас в России наблюдается явное отставание как с такими исследованиями, так и с внедрением имеющихся научных достижений в клиническую практику по сравнению с мировой тенденцией. Клинические и эпидемиологические исследования по химиопрофилактике опухолей успешно проводятся в США, Японии, Финляндии и других европейских странах. В частности, только Национальным институтом по изучению рака в США к началу 90-х годов проводилось 30 программ клинических испытаний с примерно 15 веществами по оценке возможности предупреждения рака нескольких локализаций: молочной железы, легких, тонкой кишки, пищевода, ротовой полости, шейки матки, кожи, мочевого пузыря. Существует и ряд международных программ по этой проблеме. Для выравнивания положения в отечественной онкологии неотложная задача сейчас состоит в перестановке акцентов противораковых мероприятий с упором на профилактику, как единственно перспективное направление. Необходима легализация химиопрофилактических средств (ХПС), т. е. они должны занять свое отдельное место в Фармакопее РФ. Необходимо сосредоточить больше усилий на исследовании молекуляр-
46
ных, биохимических, иммунных и эндокринных механизмов канцерогенеза в фазе индукции-промоции с тем, чтобы поиск профилактических средств был не случайным, а целенаправленным, а поэтому и более эффективным и экономичным.
Прежде всего, следует выделить общие принципы современной концепции применения ХПС, причем для удобства представить их в сравнении с противоопухолевыми препаратами, которые используются в химиотерапии рака. Цель создания ХПС - это ингибирование практически всего канцерогенеза, включающего процесс инициации, промоции и даже прогрессии опухоли. Химиотерапия имеет более узкую цель - привести опухолевую клетку к гибели или достичь увеличения продолжительности жизни больного. Объектом для применения ХПС могут быть самые различные группы: широкие популяции практически здоровых людей, лица с высоким риском развития рака, больные с предопухолевыми изменениями, а так же онкологические больные, которые лечились теми или иными методами и в настоящий момент находятся в ремиссии. Что касается противоопухолевых химиопрепаратов, то они используются только у больных с выявленными опухолями. К ХПС предъявляются жесткие требования по токсичности, исключающие какое-либо, даже минимальное побочное действие. В противоположность этому, для пропивоопухолевых химиопрепаратов в ряде случаев допускается умеренная и даже высокая токсичность. Показания к применению ХПС весьма широки и включают в себя достижение следующих возможных эффектов: уменьшение или полное исключение возможности возникновения опухолей; снижение смертности от рака (общей или определенных локализаций); предупреждение или излечение предопухолевых заболеваний; нормализацию различных сдвигов в организме или органах-мишенях, связанных с опухолевым процессом; удлинение всего процесса канцерогенеза и, особенно, периода инициации и промоции, т.е. удлинение истинного биологического латентного периода канцерогенеза.
Согласно программе, принятой в Национальном институте рака США, основные задачи по изучению новых средств для профилактики рака должны включать:
1.Идентификацию и характеристику агентов, способных в той или иной степени препятствовать канцерогенезу у животных и/или предупреждать злокачественную трансформацию клеток in vitro;
2.Идентификацию ХПС, основанную на результатах эпидемиологических исследований;
47
3.Токсикологические испытания для отбора наиболее эффективных и безопасных ХПС;
4.Проведение клинических испытаний на людях по нескольким фазам;
5.Внедрение охарактеризованных ХПС для использования в масштабах широких популяций.
Решение перечисленных задач будет эффективным только в том случае, если мы найдем ответы на вопросы, имеющие принципиальное значение:
на каких этапах канцерогенеза возможно его реальное ингибирование;
какие группы химических и биологических ингибиторов наиболее перспективны для практического применения;
каковы механизмы протекторного действия модификаторов процессов канцерогенеза;
какие тест-системы наиболее информативны в системе отбора антиканцерогенов;
какова степень корреляции антимутагенных и антиканцерогенных эффектов и как экстраполировать результаты опытов по модификации мутагенеза в антиканцерогенез;
как экстраполировать на человека результаты экспериментов по угнетению канцерогенеза in vitro и in vivo.
Для того, чтобы разобраться в столь сложном комплексе задач и
вопросов, необходимо прежде всего систематизировать известные данные об ингибиторах канцерогенеза в контексте современных представлений о молекулярных основах канцерогенеза.
В настоящее время многие специалисты разделяют мнение о том, что в происхождении злокачественных опухолей важная роль принадлежит индукции мутаций и что канцерогенез и мутагенез являются сопряженнными процессами, в основе которых лежат общие механизмы. В отличие от понятия “антимутагенеза”, открытого А. Новиком и Л. Сциллардом в 1952 г. и получившего убедительную поддержку в многочисленных исследованиях механизмов мутагенеза, понятие “антиканцерогенез” сформировалось на 20 лет позже и до сих пор не имеет безусловных объяснений. Попытки систематизации ингибиторов канцерогенеза во многом носят механистический характер и не учитывают современных знаний о действии антимутагенов и антиканцерогенов. Наиболее емкую и удобную для практического применения классификацию ингибиторов канцерогенеза разработал В.В. Худолей в 1993 г. Она представлена здесь в немного измененном виде.
48