2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Систематика_и_идентификация_энтеробактерий_Сиволодский_Е_П_

Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера является крупнейшим научным учреждением эпидемиологического профиля в Северо-ЗападномрегионеРоссии.С первых летсвоего существования и по настоящее время институт осуществляет работы по диагностике инфекционных заболеваний, разработке и производству многих видов лечебных и профилактических препаратов, обеспечению научной обоснованности противоэпидемических мероприятий в борьбе синфекционнымизаболеваниями.

Отдел новых технологий

Отдел новых технологий Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологииимениПастераразрабатываетиосуществляетпромышленныйвыпуск иммуноферментных и эритроцитарных тест-систем для диагностики различных инфекций, селективных сред, препаратов для микробиологических и иммунохимических исследований, диагностических сывороток, флуоресцирующих иммуноглобулиновидр.

Существенным преимуществом выпускаемых наборов и тест-систем является ихвысокаячувствительность,специфичностьиэкспрессность.

Наш адрес: 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, д. 14 ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Отдел новых технологий,

Телефаксы: (812) 233-17-03, (812) 325-27-10, 313-69-88 e-mail: pasteurdnt@yandex.ru Http://www.dntpasteur.ru

1. Введение

Энтеробактерии вызывают широко распространенные заболевания людей, животныхирастений.Вмедицинскомаспектеониимеютнаибольшуюзначимостькак ведущие возбудители острых кишечных инфекций (дизентерии, сальмонеллёза, брюшного тифа и паратифов, эшерихиозов, псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза), чумы, оппортунистических и госпитальных инфекций. При госпитальныхинфекцияхвСШАусловнопатогенныеэнтеробактериисоставляли54% возбудителей инфекций мочевыводящих путей, 32% хирургических ран, 38% респираторныхзаболеваний,29%бактериемий(BalowsA.I.,1991г).Приэтом80%всех госпитальных изолятов энтеробактерий составляли 3 "проблемных" вида: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Proteus mirabilis. Около 99%

клинических изолятов энтеробактерий представляли 23 вида. На долю прочих видов энтеробактерий приходилось только 1% изолятов. Установлено отсутствие медицинской значимости бактерий родов Arsenophonus, Xenorhabdus. Требует уточнения клиническая значимость бактерий родов Pragia, Rahnella, Tatumella, Yokenella,Budvicia,Buttiauxella,Leminorellaидругих.

2. Систематика энтеробактерий

За период, прошедший после выхода в 2008 году второго издания данного пособия, состав семейства Enterobacteriaceae существенно расширился. В дополнение к известным44родамвключеныеще5родовиудалены2родабактерий.Переклассифицированы, в основном, с позиций геносистематики многие виды известных родов.

Былиоткрытыболее20новыхвидовэнтеробактерий.

Таксономическое определение семейства Enterobacteriaceae, представленное в руководстве "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (1984), также сохраняет зна-

чение."Семейство Enterobacteriaceae-это грамотрицательныетонкиепалочки 0,3-1,0 х 0,6-1,0 мкм, подвижные перитрихи (кроме Tatumella) или неподвижные. Они не образуют эндоспоры или микроцисты, не кислотоустойчивы. Растут в присутствии кислородаилибезнего.Хорошоразвиваютсявпептонныхимясныхсредах,обычнона среде Мак Конки. Некоторые используют D-глюкозу как единственный источник углерода, другие требуют в качестве добавок витамины и (или) аминокислоты. Питание осуществляют за счет органических соединений; механизм метаболизма дыхательный и ферментативный. Не галлофилы. При ферментации D-глюкозы, других углеводов и многоатомных спиртов продуцируют кислоты и видимые объемы газа. Каталазоположительны,заисключениемShigelladysenteriaeсеровара1 иXenorhabdus nematophilus, оксидазонегативны. Нитраты редуцируют в нитриты, за исключением некоторых штаммов Erwinia и Yersinia. Содержание Г+Ц в ДНК 38-60 моль %. ДНК

видов,принадлежащихкбольшинствуродов,родственнымеждусобойнеболеечемна 20%. Такая же степень родства и к Escherichia coli -типовому виду всего семейства.

Исключение составляют некоторые виды Yersinia, Proteus, Providencia, Hafnia, Edwardsiella, ДНК которых имеют 10-20% родства с ДНК видов, принадлежащих к другим родам. Все изученные виды содержат энтеробактериальный общий антиген

(СА),кромеErwiniachrysanthemi.Типовойрод-EscherichiaCastellani иChalmere1919 -определен Юридической комиссией Международного комитета систематической бактериологии в 1958 году". Следует отметить, что бактерии Plesiomonas shigelloides, включенные в семейство энтеробактерий, имеют оксидазу; бактерии Serratia

marcescenssubsp.sakuensisимеютэндоспоры.

Согласно второму изданию руководства "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(2005)бактериисемействаEnterobacteriaceaeвходятвдоменBacteria,тип

Proteobacteria, класс Gammaproteobacteria, порядок Enterobacteriales. По состоянию на01.06.2011семействоEnterobacteriaceaeвключает47родов(табл.1).Представители видовиродов,имеющиемедицинскуюзначимость,представленывтабл.2.

Таблица 1. Список родов семейства Enterobacteriaceae

Таблица 2. Виды бактерий семейства Enterobacteriaceae, имеющие медицинское значение *

Обозначения:

* По « Manual of clinical microbiology » Ed.P.R.Murray, E.I.Barron, M.A.Pfaller, et al.- 1999-ASMPress. Washington.D.C. 7thed. cдополнениями.

3. Идентификация энтеробактерий

3.1 Селективно-дифференциальные питательные среды для одноэтапного

выделенияипрямойидентификации"проблемных"энтеробактерий

С 1905 года в лабораторной практике широко применяют универсальные пи- тательныесредыдлявыделенияэнтеробактерий:Мак-Конкиагар,эозин-метиленовый синий агар (Левина).Они обеспечиваюттакже рост многих видовграмотрицательных бактерийдругихсемействинекоторыхграмположительныхбактерий(энтерококков).

Для выделения патогенных энтеробактерий (сальмонелл, шигелл, иерсиний, энтеропатогенных эшерихий) используется большой арсенал селективнодифференциальных сред: сальмонелла - шигелла агар, гектоен-энтерик агар, дезоксихолат-цитратный агар, дезоксихолат-цитрат-лактоза-сульфит агар, ксилоза- лизин-дезоксихолатагар,бактоагарПлоскирева,висмут-сульфитагар,ЦИН-агаридр. Указанные среды не обеспечивают прямой идентификации бактерий, в связи с чем необходимовыделениеихвчистойкультуреипоследующаяидентификацияшироким наборомтестов,чтодлительноитрудоемко.

В целях ускорения исследования, значительного сокращения объема работы и материальных средств в последние годы разработана группа хромогенных питательных сред для одноэтапного выделения и прямой идентификации наиболее частых и значимых в медицине («проблемных») энтеробактерий. К проблемным энтеробактериям относятся сальмонеллы и другие возбудители острых диарейных инфекций,возбудителираневыхигоспитальныхинфекций(Escherichiacoli,Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Proteus mirabilis). Эти же энтеробактерии наиболее

важныдлясанитарноймикробиологии.

Хромогенные питательные среды основаны на выявлении специфических или уникальных ферментов микроорганизмов. Для обнаружения специфического фермента в состав среды включают хромогенные субстраты-вещества, при расщеплении которых образуются окрашенные или флюоресцирующие продукты (светятся в УФ свете). В результате хромогенная среда контрастно изменяет свой цвет или флюоресцирует при обнаружении искомого микроорганизма. Большинство хромогенных сред содержат также селективные добавки, подавляющие рост нежелательных бактерий. Использование хромогенных сред позволяет ускоренно (в течение суток), одноэтапно выделить и одновременно идентифицировать искомые бактерии без проведения дальнейших, дополнительных тестов (или используя 1-2 теста,выполняемыхвтечениенесколькихчасоввпределахпервыхсуток).

По таксономическому уровню различают хромогенные питательные среды групповой, родовой, видовой и внутривидовой идентификации. По завершенности исследования среды одноэтапной прямой идентификации подразделяют на среды

первичнойиокончательнойидентификации.

Дляпрямойгрупповойидентификацииколиформныхбактерийивидовойидентификации E.coli в клиническом материале, воде, пищевых продуктах производятся среды Chromacult Coliform Agar (фирмы Mercк KGaA, Германия). Комбинация двух хромогенных субстратов позволяет одновременно определить колиформные бактерии и E.coli. Фермент ß-галактозидаза, характерный для колиформных бактерий, расщепляетхромогенныйсубстратSalmonGal,чтоприводиткокрашиваниюколоний колиформных бактерий в розовый (красный) цвет. Фермент ß-глюкуронидаза, характерный для E.coli, расщепляет хромогенный субстрат Х-глюкуронид. E.coli имеетобафермента,поэтомуихколонииокрашиваютсявтемно-синий(фиолетовый) цвет и четко отличаются от колоний колиформных бактерий. Рост грамположительных бактерий подавляется тергитолом-7. Для подтверждения E.coli необходима постановка теста на индол на чашке или микрообъемным методом. Однако среда не обладает полной специфичностью (около 5% E.coli, в том числе E.coli 0157:Н7, не обладают ß-галактозидазой, а некоторые штаммы шигелл, сальмонелл, иерсиний ее

имеют).

Для прямой идентификации колиформных бактерий и E.coli в жидкой среде

предназначена среда Fluorocult LMX (фирмы Mercк KGaA, Германия). Колиформные бактериивыявляютсяпорасщеплениюхромогенногосубстратаX-Galспецифическим ферментом ß-галактозидазой, в результате чего исходный цвет среды в пробирке меняется от светло-желтого до сине-зеленого. E.coli выявляются по расщеплению флюорогеннго субстрата MUG ферментом ß-глюкуронидазой, в результате чего образуется флюоресцирующий в УФ-свете (366 нм) продукт реакции. Постановка теста на индол реактивом Ковача, в той же пробирке, позволяет надежно выявить E.coli. Все исследованиезавершаетсявтечение(18-20)чпослепосеваматериала.

К хромогенным средам внутривидовой идентификации относятся питательные среды для выделения и идентификации энтерогеморрагической E.coli 0157:H7 Fluorocult HC Agar acc. tо SZABO и CT-Sorbitol MacConkey Agar (CT-SMAK Agar),

производимые фирмой Merck (Германия). Среды предназначены для выделения этих бактерий из пищевых продуктов и клинического материала. В состав среды Fluorocult HC Agar acc. to SZABO входит сорбит с индикатором бромкрезоловый пурпурный и хромогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-ß-глюкуронид, который расщепляется ß-глюкуронидазойсобразованиемфлюоресцирующего4-метилумбеллиферона.Грам- положительнаямикрофлораподавляетсясолямижелчныхкислот.Вотличиеотостальных кишечных палочек E.coli 0157:H7 не ферментирует сорбит и не имеет ß-глюку- ронидазы. После инкубации посевов в течение (16-24)ч при температуре 41°С учет проводят двухэтапно: вначале отмечают сорбит-отрицательные колонии (неокрашенные), затем облучают колонии ультрафиолетовым светом и отмечают нефлюоресцирующие колонии. Отобранные колонии (неокрашенные, нефлюоресцирующие) дополнительно тестируют агглютинирующими сыворотками к E.coli 0157:H7 или экспрессным иммунохроматографическим тестом Singlepath E.coli 0157 (Merck, Германия) в течение 20 минут. Питательная среда CT-SMAC Agar состоит из среды Мак-Конки, в которую добавляют сорбит и суплемент СТ (цефиксим и теллурит калия). После инкубации посевов в течение (16-24)ч при температуре (35-37)°С отмечаютнеокрашенные(сорбит-негативные)колонииидополнительнотестируютих сыворотками к E.coli 0157:H7 или используют экспрессный иммунохроматографиченскийтестSinglepathE.coli0157(Merck,Германия).

Для выделения и прямой родовой идентификации сальмонелл производится хромогенная среда Rambach Agar (Merck KGaA, Германия). В состав среды входит специфический для сальмонелл субстрат пропиленгликоль. Он ферментируется сальмонеллами до кислоты, действие которой на смесь рН-индикаторов окрашивает колонии сальмонелл в красный цвет. Колиформные бактерии образуют сине-зеленые колонии, шигеллы и протеи бесцветные, слегка желтоватые колонии. Дезоксихолат натрияингибирует«роение»протеяиграмположительнуюмикрофлору.Исследуемый материал предварительно проходит этап подращивания на селективной среде обогащения для сальмонелл, затем высевается на ¼ чашки с Rambach-агаром. Учет

результатов проводят через 24 ч инкубации при температуре 37°С. Среда позволяет окончательно идентифицировать сальмонеллы с 99% специфичности и (97-99)% чувствительности. Для ускоренного селективного выделения и обогащения сальмонелл из пищевых продуктов и объектов окружающей среды фирма Merck

производит среды: DIASALM agar Salmonella, MSRV Agar Salmonella, Salmosyst

Salmonella. После подращивания на этих средах идентификация сальмонелл проводитсянасредеRambachAgar.

Для выделения и прямой идентификации бактерий рода Salmonella в клиническом материале и пищевых продуктах фирма BioMerieux (Франция) производит хромогенную среду «SM-ID». Среда основана на комбинированном действии двух хромогенных субстратов (на ß-глюкуронидазу и ß-галактозидазу) в сочетании индикатором нейтральным красным. Селективные факторы соли желчных кислот и бриллиантовый зеленый. Через (16-24) ч инкубации посевов колонии сальмонелл идентифицируются по розовой окраске (колонии прочих бактерий бесцветные, голубые или пурпуные). Идентификация недостаточно специфична: не определяются сальмонеллы подвида arizonae, сероваров gallinarum и pullorum; ложноположительными могут быть колонии некоторых штаммов эшерихий, шигелл,

морганелл,иерсиний.

Длявыделенияипрямойидентификациисальмонеллвклиническомматериалеи пищевых продуктах фирма Merck (Германия) производит среду XLT4 Agar (ксилоза- лизин-тергитол-4агар).Среда разработана MillerR.G.,TateC.R.в1990г.Селективным фактором среды является тергитол-4 (тетрадецилсульфат натрия), который добавляетсяна1лсредывколичестве4,6мл(26-28)%раствора.Всоставсредывходят лизин, ксилоза, лактоза, сахароза, феноловый красный и другие компоненты. Индикация сальмонелл проводится по черной окраске колоний, обусловленной продукцией сероводорода, который образуется только в благоприятных щелочных условиях при ферментации лизина и отсутствии, или малой интенсивности, ферментации ксилозы, лактозы, сахарозы. Через (24-48)ч инкубации посевов при температуре(35-37)°Сколониимикроорганизмовимеютследующийвид:сальмонелл - черные или красно-фиолетовые с черным центром; Citrobaсter freundii - желтые; протея-желтые,ростегоугнетен;кишечнойпалочки-желтые;шигелл-бесцветныена красном фоне среды. Следует отметить, что черную окраску колоний могут иметь бактерии Edwardsiella tarda, но они встречаются редко и легко отличимы дополнительныммикрообъемнымтестомнапродукциюиндола(3ч).

К средам групповой идентификации относится питательная среда для выделения бактерий родов протеус, провиденция, морганелла. которая производится НПО «Питательные среды» (г.Махачкала). Среда разработана А.Ф.Мороз, Л.Д.Газимуратовой, Г.Е.Афиногеновым в 1978 г. Принцип ее действия состоит в использовании узкоселективного действия поверхностноактивного вещества