2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая_микробиология_Иллюстрированное_учебное_пособие_Н_В_Литусов

181

раздевание вируса) происходит с помощью протеолитических ферментов клетки (протеаз и липаз). Смысл раздевания заключается в удалении вирусных оболочек. Конечными продуктами раздевания вирусов являются сердцевины, нуклеокапсиды или нуклеиновые кислоты. Для некоторых вирусов конечным продуктом являются нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком.

После депротеинизации вирусы невозможно выделить из культуры клеток. Этот этап репродукции известен как теневая фаза (фаза эклипса или затмения), во время которой вирус перестает существовать как оформленный вирион.

Синтез компонентов вирусов включает репликацию вирусных нуклеиновых кислот и синтез вирусных белков. В зависимости от типа вирусного генома (ДНК-содержащие или РНК-содержащие вирусы) синтез компонентов дочерних вирионов протекает либо в цитоплазме, либо в цитоплазме и ядре клетки.

У ДНК-содержащих вирусов проникший в цитоплазму нуклеокапсид транспортируется к ядру клетки. Вирусная ДНК проникает в клеточное ядро, где протекает транскрипция - переписывание информации с ДНК на РНК с помощью клеточной полимеразы. Исключение составляет ДНК-содержащий вирус оспы, у которого транскрипция протекает в цитоплазме клетки при участии вирусспецифического фермента (ДНК-полимеразы), который проникает в клетку в составе вириона. В результате транскрипции на матрице одной из нитей ДНК синтезируется иРНК, которая перемещается в цитоплазму клетки и запускает процесс трансляции – перевода генетической информации с иРНК на последовательность аминокислот в вирусных белках. Синтез белков происходит на рибосомах клетки. Одновременно в ядре клетки протекает процесс репликации (образование дочерних нуклеиновых кислот на матрице материнской ДНК). Синтезированные дочерние молекулы ДНК в составе нуклеокапсида перемещаются из ядра клетки в цитоплазму путем почкования, захватывая фрагмент ядерной мембраны. В цитоплазме клетки завершается сборка дочерних вирионов и их выход из клетки.

Таким образом, реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идет следующим образом:

ДНК → транскрипция → иРНК → трансляция → белок

Плюс-РНК-содержащие вирусы адсорбируются на специфических клеточных рецепторах и проникают внутрь клетки путем эндоцитоза. Репликация плюс-РНК вирусов происходит в цитоплазме клеток. При этом функции иРНК выполняет вирусная нуклеиновая кислота. В результате трансляции на рибосомах образуется белковая молекула, которая разрезается клеточными протеазами на структурные и неструктурные вирусные белки. При этом образуется также полимераза, которая способствует образованию минус-РНК на матрице родительской плюс-РНК. На матрице минус-РНК происходит синтез молекул плюсРНК, участвующих в биосинтезе белков дочерних вирионов. Высвобождение дочерних вирионов сопровождается лизисом клетки или происходит путем почкования. У ретровирусов при репродукции образуется промежуточный продукт в виде молекулы ДНК.

Таким образом, реализация генетической информации у позитивных РНК-

183

многих вирусных белков. Оно осуществляется клеточными ферментами в специфических точках полипептидной молекулы. После этого белки приобретают функциональную активность. Фосфорилирование характерно для белков, связанных с вирусным геномом. Оно осуществляется как вирусными, так и клеточными ферментами.

Таким образом, синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков протекает в разных структурах клетки, то есть синтез компонентов вирионов в клетке разобщен. Такой способ репродукции вирусов называется дизъюнктивным (разобщенным). Сборка дочерних вирионов возможна только при специфическом узнавании вирусных нуклеиновых кислот и белков и самопроизвольном их соединении друг с другом. У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота и белки взаимодействуют на мембранах эндоплазматического ретикулума, в результате чего формируется упорядоченная структура. У сложно устроенных вирусов сборка осуществляется многоступенчато. Вначале нуклеиновые кислоты взаимодействуют с внутренними белками, образуя нуклеокапсиды (сердцевины). Затем нуклеокапсиды выстраиваются с внутренней стороны клеточной мембраны под теми участками, которые модифицированы оболочечными вирусными белками. В результате этого происходит самосборка вирусных частиц. Количество зрелых вирионов, сформировавшихся в одной клетке, колеблется от 10 до 10000 и более.

Выход вирионов из клетки (высвобождение дочерних вирионов)

осуществляется двумя способами: путем лизиса клетки (взрывной способ выхода) и

путем почкования. Выход из клетки путем лизиса (“взрыва”) связан с деструкцией клетки. Такой способ характерен для безоболочечных вирусов, у которых отсутствует суперкапсидная оболочка. Выход вирионов из клетки путем почкования в основном характерен для оболочечных вирусов. При этом способе клетка может некоторое время сохранять жизнеспособность. Вирусы, содержащие суперкапсид, высвобождаются медленно (в течение 2-6 часов). Вначале у них суперкапсидные белки устанавливаются на наружной поверхности клеточной мембраны в виде своеобразных шипов, вытесняя клеточные белки. Затем через модифицированную клеточную мембрану проходит нуклеокапсид с образованием суперкапсидной оболочки. Весь цикл репродукции у РНК-вирусов продолжается 4-8 часов, а у ДНК-вирусов – 12-24 часа.

6.9. Культивирование вирусов

Культивирование вирусов проводят при изучении клиники и патогенеза вирусных заболеваний, при диагностике вирусных инфекций, а также для приготовления диагностических и вакцинных препаратов, используемых в вирусологии. Культивирование вирусов осуществляют в трех биологических системах:

-в организме лабораторных животных;

-в развивающихся куриных эмбрионах;

-в культурах клеток.

Для заражения биологических систем из исследуемого материала готовят суспензию, в которую добавляют антибиотики для освобождения от посторонней

185

профилактических препаратов.

Способы заражения РКЭ (рисунок 6.33):

-на ХАО;

-в аллантоисную полость;

-в амниотическую полость;

-в желточный мешок;

-в тело эмбриона.

В тело эмбриона

Валлантоисную полость

Вжелточный мешок

Желточный мешок

Рисунок 6.33 – Способы заражения куриного эмбриона.

Признаками репродукции вирусов в РКЭ является гибель эмбриона, патологоанатомические изменения в оболочках и тканях эмбриона (оспины, кровоизлияния), положительная реакция гемагглютинации. О гибели свидетельствует прекращение движений эмбриона, выявляемое при их овоскопировании, то есть просвечивании (рисунок 6.34).

Рисунок 6.34 – Овоскопирование куриных яиц.

Погибшие эмбрионы вскрывают, содержимое извлекают (рисунок 6.35) и проводят патологоанатомическое исследование. Эмбриональную жидкость смешивают с эритроцитами для определения гемагглютинации.

187

2.Суспензионные культуры клеток – клетки способны размножаться во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании. Модификацией этого метода является проточное культивирование, при котором в специальный аппарат непрерывно добавляют свежую питательную среду и удаляют отработанную.

3.Смешанные культуры клеток – способны культивироваться как на поверхности подложки, так и в суспензии.

По способу получения культуры клеток подразделяются на следующие

виды:

1.Органные культуры – цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма.

2.Первичные культуры клеток способны размножаться только в первых генерациях, то есть выдерживают не более 5-10 пассажей после выделения из тканей. Первичные культуры получают путем обработки кусочков тканей (нормальной, опухолевой, эмбриональной) протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой), которые разрушают межклеточные связи в тканях с образованием изолированных клеток. Разобщенные клетки помещают в питательную среду и вносят в стеклянный сосуд. Клетки прикрепляются к стенке сосуда и размножаются, образуя монослой (слой толщиной в одну клетку). С помощью специальных веществ (трипсина, версена) клетки можно снять с поверхности сосуда и перенести в другой. Такая манипуляция называется пассажем.

Кпервичным клеточным культурам относятся культуры фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ), клетки почек человека (КПЧ) и др. (рисунок 6.37).

а б Рисунок 6.37 – Первичная культура клеток (а - культура мышиных фибробластов: б

–культура фибробластов человека).

3.Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40-50 пассажей. Их получают обычно из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей они сохраняют диплоидный набор хромосом и не претерпевают злокачественной трансформации. В частности, к полуперевиваемым культурам клеток относится культура легких эмбриона человека (рисунок 6.38)

189

образованием шаровидных форм (рисунок 6.40).

а б Рисунок 6.40 – Проявление ЦПД: а – нормальные клетки; б – шаровидные формы.

2. Образование внутриклеточных включений. Включения могут локализоваться как в ядре (внутриядерные включения), так и в цитоплазме (цитоплазматические включения). Они представляют собой скопления вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов. Их выявляют с помощью светового или люминесцентного микроскопа после окрашивания зараженных клеток анилиновыми красителями или флюорохромами. Цитоплазматические включения формируются при натуральной оспе (тельца Гварниери), бешенстве (тельца БабешаНегри), а внутриядерные включения – при аденовирусной инфекции, герпесе (рисунок 6.41).

а б Рисунок 6.41 – Цитоплазматические включения при оспе (а) и внутриядерные

включения при аденовирусной инфекции (б).

3. Образование бляшек (негативных колоний) под агаровым покрытием. Представляют собой участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое. Видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Каждая бляшка формируется потомством одного вириона. Бляшки, образуемые разными вирусами, различаются по размеру, форме, срокам появления (рисунок 6.42).