2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая микробиология

Методы окраски

Различают:

Простые (используется 1 краситель)

Сложные (используется 2 и более красителей)

Сложные методы окраски

Окраска по Граму - для определения типа клеточной стенки

Результат: Грамположительные бактерии фиолетовые, грамотрицательные бактерии красные

Окраска по Циль Нильсену - для определения спор

1. Выкрашивают в течение 3 – 5 мин. раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения. Дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой

9

Методы окраски

2.Окрашенный препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 3 – 5 с или 96° этиловым

спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом. После обесцвечивания

остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой.

3.окрашивают дополнительно метиленовым синим Леффлера 3 – 5 мин.

Окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

Результат: Споры красные, вегетативные клетки синие

Окраска по Гинс-Бурри - для обнаружения капсул

1.На предметное стекло наносят каплю культуры и каплю туши, смешивают их краем шлифованного предметного стекла и делают препарат по типу мазка крови, затем высушивают

2.фиксируют и докрашивают 2 минуты водным фуксином.

Результат: Капсула бесцветная, тела клеток красные

10

Питание микроорганизмов. Питательные среды

Особенности механизмов питания у микроорганизмов:

Быстрота и интенсивность обменных процессов

Выраженная приспособляемость к изменяющимся условиям внешней среды

Питание осуществляется через всю поверхность клетки.

Классификация бактерий по типам питания:

По источнику энергии:

Автотрофы – бактерии, использующие в качестве источника питания неорганические соединения, которые потом превращают в органические и используют для жизнедеятельности.

Гетеротрофы – бактерии, использующие в качестве источника питания готовые органические соединения в молекулярной форме.

Сапрофиты – бактерии, использующие в качестве источника пищи мертвые органические соединения

Паратрофы – бактерии, использующие органические соединения хозяина в качестве источника питания

Фототрофы - получают энергию за счёт фотосинтеза

Хемотрофы - бактерии, получающие энергию за счёт окислительновосстановительных реакций

По факторам роста:

Прототрофы - бактерии, самостоятельно синтезирующие все необходимые вещества

Ауксотрофы - бактерии, которые не могут синтезировать факторы роста и нуждаются в их готовом виде

Паразиты – микроорганизмы, живущие на поверхности или внутри организма хозяина, питающиеся за его счёт и наносящие ему вред

Питательная среда — субстрат, применяемый для культивирования микроорганизмов или культур клеток высших организмов.

Требования к питательным средам:

1.Соответствие типу питания бактерий

2.Стерильность

3.Определенная рН

4.Наличие воды

5.Наличие ростовых факторов (микроэлементы, аминокислоты, витамины)

6.Изотоничность

11

Питание микроорганизмов. Питательные среды

Классификация питательных сред

По происхождению

Естественные - среды природного или растительного происхождения Примеры: молоко, желатин, картофель, овощные или фруктовые соки, отвары или экстракты)

Искусственные - среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта) Примеры: Мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ) мясопептонный агар (МПА)

Синтетические - среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений (солей, аминокислот, углеводов) Примеры: глюкозо-солевая питательная среда

По составу

Простые – среды с минимальным набором питательных веществ. Примеры: мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ), пептонная вода;

Сложные – многокомпонентные среды, состоящие, как правило из МПА (МПБ) с добавлением дополнительного питательного компонента (кровь, сахар, соль, желчь). Примеры: кровяной агар, сахарный бульон, желточный агар

По консистенции

Плотные (АГАРЫ) - среду, которые содержат 3–5 % агар-агара используют для выделения чистых культур, морфологии колоний, диагностических целей, хранения культур, количественного учета, изучения антагонистических свойств. Примеры: мясопептонный агар, свёрнутая сыворотка

Полужидкие - среды, которые содержат 0,15—0,7 % агар-агара используют для хранения культур, реже - для накопления биомассы. Примеры: 0,2-0,5 мясопептонный агар

Жидкие (БУЛЬОНЫ) - среды, которые не содержат агар-агара, их применяют для изучения биохимических и физиологических свойств микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, хранения микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах. Примеры: мясопептонный бульон, сахарный бульон

12

По назначению

Общего назначения (основные питательные среды) - пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и могут применяться в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. Примеры: питательный бульон, питательный агар

Специального назначения

дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим среды. Примеры: среда Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса, Ресселя

обогащения (накопления):

селективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а рост других подавляется. Примеры: o щелочной бульон, 1 % пептонная вода, желточно-солевой агар, казеиновоугольный агар

элективные – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей. Примеры: сывороточный бульон, среда Мюллера, Леффлера

Консервирующие (транспортные) среды - используются для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева и подавления размножения сопутствующей флоры в период транспортировки образцов. Примеры: Глицериново-солевая смесь

13

Дыхание бактерий

Классификация бактерий по типам дыхания

Облигатные аэробы – микроорганизмы, способные получать энергию только путем аэробного дыхания и постоянно нуждающиеся в молекулярном кислороде (O2).

Облигатные анаэробы – микроорганизмы, способные расти только в среде, лишенной молекулярного кислорода, поскольку он для них токсичен.

Микроаэрофилы – микроорганизмы, размножающиеся только при пониженном парциальном давлении кислорода в окружающей среде.

Факультативные анаэробы – микроорганизмы, способные расти и развиваться как в присутствии, так и в отсутствии молекулярного кислорода (O2).

Аэротолерантные бактерии - бактерии, которые не нуждаются в кислороде, но могут жить в его присутствии

14

Размножение и рост бактерий

Размножение – увеличение числа особей.

Способы размножения бактерий:

а) деление клетки на 2 части (бинарное деление) - используется чаще всего б) почкование; в) распад нитевидных клеток;

г) при помощи спор (актиномицеты).

Механизм деления бактерий

Репликация. Деление бактериальной клетки начинается после завершения репликации бактериальной хромосомы.

Удвоение генетического материала. Каждая из двух нитей ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи ДНК. В результате удвоения родительской ДНК происходит образование двуспиральных дочерних молекул ДНК.

Формирование поперечной перегородки. В средней части клетки формируется поперечная перегородка (септа), которая делит цитоплазму материнской клетки на две дочерние. Одновременно с этим синтезируется клеточная стенка, образующая полноценную перегородку между двумя дочерними клетками.

Образование двух дочерних клеток.

Размножение бактерий состоит из 4 фаз:

Лаг-фаза. Адаптация бактерий к питательной среде

Логарифмическая фаза. Активное размножение бактерий с геометрической прогрессией

Стационарная фаза. Постоянное число бактерий в среде.

Фаза отмирания (гибели). Менее жизнеспособные бактерии отмирают и общее количество бактерий уменьшается.

Рост – воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее к увеличению массы клетки.

15

Размножение и рост бактерий

Основные виды роста микроорганизмов на жидких питательных средах (бульонах)

Рост бактерий с равномерным помутнением среды.

Цвет среды может быть неизмененным или из¬меняется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроба. Такой рост характерен для многих патогенных бактерий (факультативные анаэробы).

Придонный рост. На дне пробирки образуется осадок, он может быть скудным, обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым, в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды такой же как окраска пигмента, продуцируемого культурой микробов. Если культура пигмента не образует, цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как прави¬ло, серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания.

Пристеночный рост. Питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к внутренней поверхности стенок со¬суда, с которых в зависимости от вида бактерий снимаются легко или с трудом.

Поверхностный рост. На поверхности жидкой питательной среды образуется пленка, внешний вид и характер которой могут быть раз¬личны. Поверхностный рост зависит от вида бактерии по типу питания,

16

Культуральные свойства бактерий

КОЛОНИЯ – видимое невооруженным глазом скопление бактерий на поверхности или в толще плотной питательной среды. Колония представляет собой потомство бактериальной клетки одного вида.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА – свойства, характеризующие особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах (внешний вид и форма колоний, способ роста, требования к ее составу, аэробные или анаэробные условия).

ЧИСТАЯ КУЛЬТУРА – микроорганизмы одного вида, выращенные на плотной или в жидкой питательной среде в лабораторных условиях.

Свойства колоний бактерий:

форму колонии округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная;

размер (диаметр) колонии

очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм),

мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) крупные (более 5 мм в диаметре);

поверхность колонии

гладкая,

шероховатая,

складчатая,

морщинистая,

с концентрическими кругами радиально исчерченная;

18