2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая микробиология

Метод мембранных фильтров: для фильтрации воды используют специальный фильтрационный прибор и воронку.

-В воронку фильтровального прибора наливают отмеренный объем исследуемой воды. По окончании

фильтрации снимают фильтр и

накладывают его на среду Эндо в чашке Петри.

-Культивируют и изучают (отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ). Из подозрительных колоний делают мазки.

-При наличии грамотрицательных

палочек ставят пробу на оксидазу.

Положительная оксидазная проба дает

право дать отрицательный ответ. При

отрицательной оксидазной пробе проводят титрационный метод для

определения коли-индекса.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий:

Сулъфитредуцирующие клостридии - спорообразующие анаэробные палочки, редуцирующие

сульфит натрия на специальных средах.

-Пробу воды 20 мл прогревают для исключения вегетативных форм (нам нужны только

споры).

-Из каждой пробы питьевой воды делают прямой посев на горячий железо-сульфитный агар или фильтруют 20 мл (затем добавляют фильтр в горячий железо-сульфитный агар).

-Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой и культивируют.

-Изучают среду на наличие специфических колоний. 1 бактерия размножается и обрузует 1 колонию;таким образом можно составить пропорцию и узнать, сколько бактерий было в 20 мл исследуемой воды.

Определение колифагов:

Колифаги – вирусы E. coli.

-Засеивают лабораторные штаммы E. coli на специальную питательную среду.

-Добавляют образец исследуемой воды (предварительно очищенной от бактерий) и культивируют.

- Если бактериофаг присутствовал в образце, то наблюдают частичный лизис бактерий (в виде стерильных пятен или образования бляшек), либо полное отсутствие роста E. coli на среде.

Определение цист лямблий:

Цисты патогенных простейших кишечника и яйца гельминтов обнаруживаются при

микроскопическом исследовании осадка, получаемого после центрифугирования образца

воды с добавлением специального раствора. Полученный осадок микроскопируют.

Исследование воздуха:

Микроорганизмы находятся в воздухе в форме аэрозоля. Микробный аэрозоль – это взвесь в

воздухе живых или убитых бактерий, адсорбированных на пылевых частицах или

заключенных в «капельные ядра».

Контроль микрофлоры воздуха осуществляется при необходимости дать оценку санитарного состояния аптек, детских учреждений, операционных и перевязочных хирургических, а также акушерско-гинекологических отделений, асептических палат, боксов. При обследовании воздуха медицинских учреждений применимы методы определения количества микроорганизмов в воздухе с последующим выявлением санитарно-показательных микроорганизмов.

Общее микробное число (общая микробная обсемененность) - это количество клеток микроорганизмов в 1 м3 воздуха, выросших при

посеве на поверхности питательного агара.

 НОРМАТИВЫ

В качестве санитарно-показательных микроорганизмов

исследуются представители нормофлоры кожи и вержних дыхательных путей: золотистый

стафилококк, стрептококки грамотрицательные бактерии, гемолитическая микрофлора,

грибы.

Седементационный метод (метод Коха) – основан на естественном осаждении микробов под

действием их тяжести на поверхность плотной питательной среды: чашку Петри со средой оставляют открытой на определенное время (считается, что за 15-20 минут через чашку Петри

проходит 10 л воздуха (0,01 м3)). После инкубации подсчитывают число выросших колоний.

1) Определение ОМЧ (метод Коха):

-Оставляют чашку Петри с питательной средой на 15-20 минут;

-Культивируют, посчитывают количество колоний и составляют пропорцию. 2) Определение СМП (метод Коха):

-Оставляют чашку Петри со специальной питательной средой на 15-20 минут;

-Культивируют, посчитывают количество колоний и составляют пропорцию.

Аспирационный метод - основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из

воздуха на поверхность плотной питательной среды при помощи импакторов) или в улавливающую жидкость(при помощи импинджеров).

Импакторы – приборы, в которых происходит принудительное осаждение микробов из прокачиваемого через прибор воздуха на поверхность плотной питательной среды.

1)Определение ОМЧ аспирационным методом при помощи импакторов:

- При помощи импактора прогоняют через

питательную среду определенное количество воздуха;

- Культивируют, посчитывают количество колоний и составляют пропорцию.

2)Определение СМП аспирационным методом при помощи импакторов:

-При помощи импактора прогоняют через специальную питательную среду определенное количество воздуха;

-Культивируют, посчитывают количество колоний и составляют пропорцию. Импинджеры – приборы, в которых воздух проходит через жидкость

(стерильную воду, физраствор, питательный бульон), в результате чего

микробы задерживаются в ней и могут быть обнаружены.

1) Определение ОМЧ аспирационным методом при помощи импинджеров:

- При помощи импактора прогоняют определенное количество воздуха через жидкость;

- Производят исследование воды с последующим посевом на питательные среды. 2) Определение СМП аспирационным методом при помощи импинджеров:

-При помощи импактора прогоняют определенное количество воздуха через жидкость;

-Производят исследование воды с последующим посевом на специальные питательные

среды.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ:

Классификация ферментов бактерий:

1) По месту реализации:

-Экзоферменты – это ферменты, не связанные с цитоплазмой клетки, они свободно

выделяются во внешнюю среду.

-Эндоферменты – это ферменты, которые прочно связаны с цитоплазмой клетки, они осуществляют свою деятельность внутри клетки.

2)По механизму действия: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы,

лигазы (синтетазы).

3)По зависимости своего синтеза от наличия субстрата или продукта.

-Конститутивные ферменты синтезируются постоянно, вне зависимости от наличия в данный момент субстрата.

-Индуцибельные ферменты синтезируются бактериальной клеткой только в присутствии

субстрата для их действия.

-Репрессибельные ферменты это те, синтез которых подавляется избытком продукта

реакции.

4) По субстрату воздействия: сахаролитические, протеолитические, липолитические.

Требования к искусственным питательным средам:

-должны содержать необходимые питательные вещества, т.е. обладать питательностью;

-иметь достаточную влажность (наличие воды);

-иметь оптимальную рН (7,2-7,6) кислотность среды;

-необходимое осмотическое давление (обладать изотоничностью (концентрация NaCl

0,87%));

-содержать кислород (кроме облигатных анаэробов);

-быть прозрачными, чтобы был виден рост бактерий;

-быть стерильными (чтобы не было других бактерий).

Условия культивирования бактерий:

-Наличие полноценной питательной среды.

-Определенная температура культивирования (оптимальная температура 37°С).

Термофилы от 50 до 60°С, психрофилы от –10 до +20°С.

-Определенная атмосфера культивирования.

Для строгих аэробов необходим кислород, поэтому они хорошо растут на поверхности агара чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для роста аэробов в глубинном слое

жидкой среды необходимо непрерывно перемешивать или встряхивать питательные среды,

чтобы кислород распределялся по всему объему среды. Для факультативных анаэробов

используют те же методы.

Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода. Концентрация СО2 должна быть 1-5%. Для этого используют специальные СО2 –инкубаторы или посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горячую свечу.

Для роста облигатных анаэробов необходимо исключить доступ кислорода. Для этого добавляют к питательным средам редуцирующих кислород веществ (тиогликолевая кислота), регенерация от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения,

использование поглотителей кислорода, помещая их в герметически закрываемые емкости

«газпаки», использование анаэростатов.

-Время культивирования (18-48 часов). Для культивирования микобактерий туберкулеза (3-4 недели).

-Освещение. Для выращивания фототрофных бактерий необходим свет.

-Культивирование облигатных внутриклеточных паразитов-бактерий, относящихся к родам риккетсия, эрлихия, коксиелла, хламидия осуществляют на культурах клеток или в организме животных и членистоногих, а также в куриных эмбрионах.

Классификация искусственных питательных сред:

1) По консистенции:

-жидкие (мясопептонный бульон, сахарный бульон);

-плотные (1-2% мясопептонный агар, свернутая сыворотка);

-полужидкие (0,2-0, 5% мясопептонный агар) питательные среды.

Для получения питательной среды с плотной консистенции к жидкой среде добавляют обычно агар-агар или желатин - вещество белковой природы животного происхождения.

2)По составу среды могут быть простыми (мясопептонный бульон (МПБ),

мясопептонный агар (МПА)) и сложными (это простые с добавлением дополнительного

питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный

бульон, сывороточные агар и бульон и др.).

3)По происхождению:

-естественные (молоко, желатин, картофель и др.), заметим, что только со

специальными добавками, если не хотите получить обычную плесень;

-искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);

-синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений (солей, аминокислот, углеводов и т. д.).

4) По назначению:

- общего назначения (универсальные) – предназначены для культивирования большинства бактерий, так как содержат питательные вещества, в присутствии которых

растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар).

- специального назначения применяются для выращивания бактерий, не способных размножаться на универсальных средах:

а) элективные (селективные) – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется (например, в щелочной пептонной воде и щелочном мясопептонном бульоне интенсивнее по сравнению с другими сопутствующими

бактериями растет холерный вибрион).

б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среды Эндо, Левина, Плоскирева и др.). Кроме того, к дифференциально-

диагностическим средам относят и специальные среды, позволяющие определить

способность бактерий утилизировать тот или иной субстрат ( например, среды Гиса с углеводами и мясопептонный желатин).

в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида, т. е. обогащение ими исследуемого материала (селенитовый бульон).

Выделение и идентификация чистых культур бактерий (бактериологический метод):

1) Получение чистой культуры (1 вид бактерий, выросший на питательной среде). Часто посев

приходится проводить несколько раз, чтобы выделить чистую культуру.

Методы получения чистых культур:

- Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды:

а) Метод истощающего штриха секторами;

б) Метод истощающего однократного штриха:

в) Метод Коха:

г) Метод Дригальского:

Берут 3 чашки с плотной средой. На середину первой петлей или пипеткой вносят каплю посевного материала и круговыми движениями шпателя или чашки производят сплошной посев

Этим же шпателем, не стерилизуя его, распределяют материал по второй и третьей

чашкам.

-Использование элективных питательных сред.

-Создание условий, благоприятных для развития одного вида (рода) бактерий (среды

обогащения).

2) Идентификация чистой культуры. - Изучение культуральных свойств:

Форма (плоская, округлая, иметь ровные, хорошо очерченные или рваные края...).

Размер (мелкие, крупные).

Пропускание света (прозрачные, непрозрачные). Поверхность(шероховатая, гладкой, морщинистой,

блестящей...).

Структура (при микроскопии однородная, неоднородная).

Цвет (при наличии пигментов).

Консистенция (слизистые, мягкие, плотные и врастающие в агар).

В жидком субстрате морфология бактериальных колоний характеризуется образованием

равномерной мути, пленки или осадка. В полужидких при посеве уколами подвижные бактерии вызывают помутнение в толще среды вокруг места посева, а неподвижные – только

в самом месте укола. Некоторые бактерии в аэробных и анаэробных условиях выделяют различные газы (индол, скатол, меркаптан, сероводород, масляная кислота, диэтиловый эфир и тому подобное).

- Приготовление мазка и окраска по Граму.

3) Идентификация по биохимических свойствам.

Делают посевы на дифференциально-диагностические среды. Проводят различные тесты.

Определение основных биохимических свойств:

-Сахаролитические (посев на среды Гисса («пестрый ряд»));

-Протеолитические.

Разжижение желатина (при посеве бактерий, обладающих этими ферментами, на желатин

происходит его разжижение).

Показателями более глубокого расщепления белка являются его конечные продукты: индол (индикатор становится розовым), аммиак (посинение лакмусовой бумажки), сероводород

(почернение индикатора) и др.

Для определения этих газообразных веществ производят посев чистой культуры бактерий в бульон или пептонную воду. В пробирки с засеянной средой между стенкой пробирки и пробкой помещают индикаторную бумагу .

-1 разжижение желатина;

-2 определение сероводорода;

-3 определение индола;

4)Определение антигенных свойств (реакции иммунитета).

5)Определение чувствительностви к антибиотикам (метод дисков и метод серийных разведений).

6)При необходимости фаготипирование (эпидемиологическое маркирование).

Создание анаэробных условий для культивирования облигатных анаэробов:

1) Физические методы:

- Посев материала в глубину плотных питательных сред.

Посев производят путем «укола» бак иглой или петлей в пробирку со столбиком плотной среды (с высоким столбиком сахарозного агара). Либо ведут посев в расплавленную плотную

или полужидкую питательную среду с последующим перемешиванием. В данном случае

рост должен происходить в нижних слоях агара (там меньше О2).

- Метод глубинного посева.

Поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и

вазелина (1:1). Закрывают резиновой пробкой. Чтобы извлечь выросшие колонии (анаэробов),

пробирки слегка нагревают. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают

стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей и переносят в жидкую

среду.

- Использование редуцирующих, окисляющих веществ и масла.

Эти вещества добавляют в питательную среду. Редуцирующими (связывающими) веществами являются: кусочки животных тканей (печени, кожи, сердца, костного мозга), кусочки

растительных тканей, кусочки ваты, тиогликолят натрия, солянокислый цистеин. Окисляющими веществами (антиоксидантами) является глюкоза. Примеры сред: Китта-

Тароци.

-Использование анаэростатов.

-Культивирование в атмосфера инертного газа.

При помощи специального аппарата кислород заменяется инертным газом.

2) Химические методы.

Эти методы основаны на применении различных химических веществ, в результате

взаимодействия веществ происходит химическая реакция с активным поглощением О2

воздуха.

3) Биологические методы.

При совместном культивировании анаэробов и аэробов в чашке Петри, создаются анаэробные условия за счет того, что аэробы растут первыми и поглощают О2, имеющийся в чашке.

Чашка должна быть запаена парафином.

4) Комбинированный метод.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОБЛИГАТНЫХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАЗИТОВ :

МОДЕЛИ:

Для культивирования вирусов используют:

-чувствительных лабораторных животных;

-куриные эмбрионы;

-культуры клеток.

Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

1) Чувствительные лабораторные животные:

Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).

Плюсы: возможность выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре

или эмбрионе.

Минусы: контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.

2) Куриные эмбрионы:

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических

целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы)

используют 8—12-дневные куриные эмбрионы.

Плюсы: редко бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, обладают сравнительно

высокой жизнеспособностью.

Минусы: невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку при изготовлении препаратов.