2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Курс лекций по микробиологии
.pdfПрофаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из бактериальной хромосомы и вызывать продуктивную инфекцию.
Умеренные и дефектные фаги
Встраиваясь в бактериальную хромосому, умеренные или дефектные фаги вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки. Изменчивость лизогенных бактерий может быть связана:
•с приобретением генов, переносимых фагами от их предыдущих хозяев;
•с экспрессией «молчащих» генов бактерий-реципиентов. Фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий.
Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойновоспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний).
Практическое использование бактериофагов:
•фаготерапия;
•фагопрофилактика;
•фагодиагностика.
ГЕНЕТИКА ― наука, изучающая механизмы и закономерности наследственности и изменчивости организмов, а также методы управления этими процессами.
Ген ― наследственный фактор, единица наследственного материала ― определенный участок молекулы ДНК у высших организмов (РНК у ряда вирусов), ответственный за синтез определенного белка.
Генотип ― совокупность всех генов организма, его наследственная материальная основа.
Фенотип ― совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся на основе взаимодействия генотипа с условиями внешней среды.
31
Генетический материал у бактерий содержится в нуклеоиде (бактериальной хромосоме) и во внехромосомных генетических элементах
— плазмидах и мигрирующих генетических элементах.
Внехромосомные факторы наследственности
1)автономные – являются репликоном:
•плазмиды
2)неавтономные ― реплицируются только в составе репликона (нуклеоида или плазмиды):
•IS-последовательности;
•транспозоны;
•умеренные и дефектные фаги.
Внехромосомные молекулы ДНК (инсерционные элементы, плазмиды, транспозоны) не являются жизненно важными для бактерий, но придают им новые свойства.
Инсерционные элементы (IS) (от англ. insertion sequence) —
простейший тип генетических элементов, мигрирующих от одной бактериальной хромосомы к другой, или между хромосомой и плазмидой. IS-элементы несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Содержат только гены, необходимые для собственной миграции. Фенотипических признаков не кодируют, самостоятельно не реплицируются.
Свойства IS-последовательностей:
•небольшие размеры ― 800−1400 пар нуклеотидов;
•в свободном состоянии не существуют;
•способны перемещаться по геному, при этом первичный элемент остается на месте, а копия встраивается в мишень.
Функции IS-элементов:
•координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации;
•регуляторная (регуляция транскрипции генов путем их «включения/выключения»);
•индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5−9 пар нуклеотидов) координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов.
Транспозоны — нуклеотидные последовательности, способные менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую.
32
Свойства транспозонов:
•относительно большие генетические элементы, состоят из 2000−25000 пар нуклеотидов;
•могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы;
•могут мигрировать с одного репликона на другой;
•окружены с обоих сторон (фланкированы) последовательностями ДНК, напоминающими IS-последовательности;
•могут нести информацию о синтезе бактериальных токсинов и ферментов, модифицирующих антибиотики.
Плазмиды — кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации. Их возможные состояния:
•автономное (в цитоплазме);
•интегрированное (в нуклеоиде).
Конъюгативные плазмиды способны к самопереносу из одной клетки в другую. Неконъюгативные плазмиды способны к переносу с помощью конътативных плазмид и бактериофагов.
Функции плазмид:
•регуляторная – компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида;
•кодирующая – вносит в генотип новую информацию.
Плазмиды подразделяются на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий.
F-плазмида, или половой фактор. Контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. F- плазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов.
Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F- плазмиды (от англ. transfer — перенос), обеспечивающим конъюгативность. F-плазмиды содержат только tra-оперон, в их составе нет никаких других генов.
F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому и находиться с ней в интегрированном состоянии.
Функции tra-оперона:
•детерминирует образование конъюгативных пилей;
•моблизирует на перенос:
–саму конъюгативную плазмиду (F+);
–другую, неконъюгативную, плазмиду;
–участок нуклеоида.
33
R-плазмиды (плазмиды множественной лекарственной устойчивости).
Известно большое количество R-плазмид, определяющих устойчивость бактерий к лекарственным препаратам. Передача R-плазмид привела к их широкому распространению среди бактерий и значительно осложнило химиотерапию инфекционных заболеваний.
Состав R-плазмид:
•r-оперон(-ы) + tra-оперон;
•r-оперон(-ы).
Пути передачи R-плазмид:
•при трансдукции (грамположительные бактерии);
•при конъюгации (грамотрицательные бактерии).
Состав r-оперона:
•гены, детерминирующие синтез ферментов:
–инактивирующие антибиотик;
–модифицирующий антибиотик;
–снижающие проницаемость клеточной стенки бактериальной клетки к антибиотику;
•может содержать:
–транспозон;
–IS-последовательность.
Бактериоциногенные плазмиды (на примере Col-плазмиды E.coli) ―
плазмиды, детерминирующие синтез колицинов (антибиотикоподобных веществ).
Состав Col-плазмид:
• гены, детерминирующие синтез колицина;
•tra-оперон. Особенности Col-плазмид:
•редко интегрируют в нуклеоид;
•обычно репрессированы;
•при их дерепрессии бактериальная клетка синтезирует колицины и погибает (потенциально летальная плазмида).
Свойства бактериоцинов:
•представляют собой вещества белковой природы и функционируют как антибиотики с узким спектром действия;
•вызывают гибель клетки, не нарушая ее целостности;
•ингибируют синтез ДНК, РНК и белка;
•обладают свойствами эндодезоксирибонуклеаз;
34
•обладают летальным признаком – после выделения бактериоцина бактериальная клетка может погибнуть;
•клетка, выделяющая бактериоцины, устойчива к действию гомологичных бактериоцинов извне.
ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ
Может быть ненаследуемой (модификационной) и генотипической (мутации, рекомбинации).
Модификации ― временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды. Модификации находятся под контролем генома, но не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются. Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и ряда других признаков.
Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее расщепления.
Лактозный оперон состоит из трех линейно расположенных структурных генов, деятельность которых контролируется геном-регулятором.
Структурные гены детерминируют образование трех катаболических ферментов: бета-галактозидазы, трансацетилазы и пермеазы. Работа структурных генов зависит от гена-регулятора и наличия в среде лактозы. Ген-регулятор контролирует образование белка-репрессора. Белок-репрессор при отсутствии лактозы связывается с оператором и блокирует транскрипцию. Поступая в клетку, лактоза связывается с белком-репрессором, в результате освобождается оператор и включается синтез катаболических ферментов на структурных генах.
После полной утилизации лактозы белок-репрессор освобождается и вновь связывается с оператором, блокирует процесс синтеза ферментов.
R-S-диссоциация бактерий ― это образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на тплотной питательной среде. Один тип — R-колонии (англ. rough — неровный) — характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип — S-колонии (англ. smooth — гладкий) ― имеет круглую форму, гладкую поверхность.
Диссоциацию большинство ученых рассматривают как закономерную форму модификации, а некоторые относят ее к мутациям.
Процесс диссоциации обычно протекает в одном направлении: от S- к R- форме. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для
35
большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний.
В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.
S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.
Свойства бактерий из S- и R-колоний
S-колонии |
R-колонии |
|
|
Гладкие сровнымикраями |
Шероховатыесизрезаннымикраями |
|
|
Диффузно-мутящийроствМПБ |
ПридонныйроствМПБ |
|
|
Обычновирулентны |
Обычно не вирулентны, за |
|
исключением возбудителей |
|
туберкулеза, сибирской язвы, |
|
дифтерии, чумы |
|
|
У капсульных видовесть капсула |
Капсула отсутствует |
|
|
У подвижных видовесть жгутики |
Жгутикиотсутствуют |
|
|
Чувствительны к фагу |
Малочувствительныкфагу |
|
|
Биохимическиболееактивны |
Биохимическименееактивны |
|
|
Полноценнывантигенном |
Неполноценнывантигенном |
отношении |
отношении |
|
|
ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ
Мутации ― это изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какоголибо признака. Одновременно у бактерий имеются различные механизмы репарации мутаций, в том числе с использованием ферментов ― эндонуклеаз, лигаз, ДНК-полимеразы.
Генетические рекомбинации
Трансформация — форма генетической изменчивости, при которой бактерия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток.
Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз:
1)адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте;
2)проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;
36
3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.
Эффективность трансформации зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, и тем больше образуется рекомбинантных бактерий. Межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая.
Трансдукция ― перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага. Фаг переносит небольшой фрагмент ДНК бактерии-донора. В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки: ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам, вредным воздействиям окружающей среды, вирулентность и др. При выходе бактериофага из клетки фрагмент донорской трансдуцированной ДНК остается в хромосоме клетки-реципиента, а следовательно, сохраняются и новые фенотипические признаки. Бактериофаг при трансдукции выполняет только транспортную функцию.
Типы трансдукций
1.Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора. В клетки реципиентного штамма могут быть перенесены любые гены донора. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим. Фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов.
2.Специфическая трансдукция осуществляется фагами, обладающими избирательной локализацией на хромосоме бактерий. Образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.
3.Абортивная трансдукция. Принесенный трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически.
37
Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве. Конъюгация ― однонаправленная передача генетической информации в результате непосредственного контакта между донорной и реципиентной клетками.
Необходимым условием для конъюгации является наличие у бактериидонора F-плазмиды (полового фактоpa), которая контролирует синтез половых ворсинок (sex-pili). Бактерии, имеющие F-плазмиду, называются мужскими (F+) клетками. Женские (F-) клетки не имеют этой плазмиды. Процесс конъюгации между F+ и F- клетками имеет следующие стадии:
1)установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых ворсинок;
2)прохождение генетического материала через канал половой ворсинки от донора к реципиенту;
3)рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ УЧЕНИЯ О ГЕНЕТИКЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Генная инженерия в медицинской микробиологии
Продукты, получаемые генно-инженерным способом с помощью рекомбинантных штаммов бактерий:
•вакцины;
•гормоны;
•интерфероны;
•цитокины.
Генетические методы, применяемые в микробиологической диагностике:
•процентное содержание Г+Ц бактериальном геноме;
•метод молекулярной гибридизации;
•полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Полимеразная цепная реакция. Цели:
•обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры;
•идентификация микроорганизмов;
•генотипирование микроорганизмов.
Этапы проведения ПЦР:
•выделение ДНК из патологического материала;
•добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена), добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов;
38
•нагревание;
•расплетение ДНК на две нити;
•охлаждение;
•связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена;
•нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров, ДНКполимераза достраивает вторые цепочки ДНК;
•повторение циклов (30−50) – накопление (амплификация) искомого гена;
•резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена;
•определение продуктов ПЦР с помощью электрофореза.
39
Лекция 5
Противомикробные мероприятия.
Микробиологические основы химиотерапии бактериальных инфекций.
Вмедицинской практике часто требуется контролировать нежелательный микробный рост, ограничивать его появление и скорость, частично или полностью уничтожать микроорганизмы во внешней среде или в живых тканях. Для этого используют физические, химические, биологические или комплексные воздействия на микроорганизмы. Эффект от таких воздействий может быть микробицидным (гибель микроорганизмов) или микробостатическим (прекращение их роста и размножения).
Взависимости от характера и целей антимикробного воздействия различают:
•дезинфекцию — уничтожение на абиотических объектах патогенных микробов (обеззараживание объектов);
•стерилизацию — полное уничтожение на абиотических объектах жизнеспособных микроорганизмов и их спор (обеспложивание объектов);
•антисептику — уничтожение или ограничение роста микроорганизмов в живых тканях;
•деконтаминацию — удаление микробного загрязнения объектов до безопасного уровня;
•консервацию — предотвращение роста и размножения микроорганизмов на объектах.
Дезинфекция — это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение на абиотических объектах патогенных микробов. После дезинфекции могут сохраняться споры микроорганизмов, вегетативные формы погибают.
В медицине применяют физические и химические методы дезинфекции.
Физические методы:
•механические (вытряхивание, проветривание, влажная уборка, стирка с моющим средством);
•действие высокой температуры (проглаживание утюгом, кипячение, пастеризация);
•УФО (облучение бактерицидными лампами);
•ультразвук.
Химические методы. При дезинфекции химическим методом применяют следующие дезинфицирующие вещества:
40