Техника
иммуноблота
Вестерн блоттинг
(белковый иммуноблот)
• Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце.
• В его основе лежит явление высокоспецифичного
взаимодействия антиген–антитело.
Таким образом, антигеном (мишенью) является определяемый
белок, а зондом – антитело к нему.
Антитела к исследуемому
белку
• первичные антитела, которые 
взаимодействуют с белком-
мишенью (введение очищенной пробы белка в кровяное русло лабораторного животного).
•
вторичные антитела несут изотопную или нерадиоактивную метку (конъюгированные антииммуноглобулины, являющиеся антителами к антителам)
История
• Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка в Стэнфорде. Название вестерн блот было дано технике У. Нейлом Бурнеттом и является игрой слов от названия Саузерн блоттинг, — методики определения ДНК, 
разработанной ранее Эдвином Саузерном. Аналогичный метод определения РНК называется нозерн блоттингом, детекция посттрансляционных модификаций белков называется истерн блоттингом.
Этапы
проведения иммуноблота
Подготовка образца
• Образец из цельной ткани или из клеточной культуры.
• Твёрдые ткани сначала измельчаются механически с использованием блендера, гомогенизатора или обработки ультразвуком.
• Различные детергенты, соли и буферы применяются для улучшения лизиса клеток и 
растворения белков.
• Ингибиторы протеаз и фосфатаз добавляются для предотвращения расщепления образцов их собственными ферментами.
• Подготовка тканей часто выполняется при низких температурах, чтобы избежать денатурации белка.
Гель-электрофорез
• Белки разделяются при помощи электрофореза в полиакриламидном геле.
• Разделение белков можно производить по изоэлектрической точке (pI), молекулярной массе, электрическому заряду или по сочетанию этих 
параметров.
• Присутствие додецилсульфата натрия (SDS) вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном 
состоянии
Гель-электрофорез
• Молекулы белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, пройдут в геле одинаковый путь и выстроятся в виде 
полосы. Поскольку в смеси присутствуют белковые молекулы разного размера, образуется множество
полос.
Перенос на мембрану
• Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида.
• Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной 
бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, уносит с собой белки.
• Другой метод переноса белков называется электроблоттингом и использует электрический ток, который переносит
белки из геля на мембрану.