6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Статья_Храмцов_П_В_,_Бочкова_М_С_,_Раев_М_Б_Исследование_функциональных

оборудования, а также наличия специалистов с со-

менениям условий окружающей среды, влияющих

ответствующей высокой квалификацией [Родионов,

на структуру поверхности твердой фазы, и доступ-

2007].

ность сорбированного антигена для молекул соот-

Таким образом, в современной клинико-диагно-

ветствующей специфичности. По-разному прояв-

стической практике отсутствует метод, пригодный

ляется активность контаминирующей микрофлоры,

для осуществления массовых диагностических ме-

приводящая к деградации антигена. Таким образом,

роприятий, сочетающий в себе процедурную про-

структура и технология получения иммуносорбента

стоту и оперативность с надлежащими аналитиче-

существенным образом определяют условия и дли-

скими свойствами, сравнимыми с показателями

тельность хранения тест-системы.

ИФА и РИФ.

Целью работы являлось определение оптималь-

В сложившихся условиях перспективной являет-

ных параметров синтеза и хранения иммуносорбен-

ся разработка скрининговой аналитической системы

тов, сконструированных на основе антигена р17 T.

на основе углеродного диагностикума, представ-

pallidum.

ляющего собой суспензию наноразмерных частиц

углерода, конъюгированных с аффинным соедине-

Материалы и методы

нием посредством системы ковалентных связей.

Материалы

Подобные системы, ранее разработанные в нашей

лаборатории, обладают простотой, оперативностью,

Для тестирования использовали антиген бледной

специфичностью, достаточными для использования

трепонемы р17 производства ЗАО БТК «Биосервис»

в качестве

скрининговых

тестов [Раев, 2012]. В

(Россия), стандартную референсную панель сыворо-

частности

были

сконструированы твердофазные

ток, содержащих и

не

содержащих антитела к

дот-иммуноаналитические

системы

определения

Treponema pallidum

ЗАО

«Медико-биологический

антител к столбнячному анатоксину, токсину возбу-

союз» (Россия), материалы твердой фазы: полисти-

дителя псевдотуберкулеза,

ВИЧ [Раев, Амбросов,

рольные плоскодонные планшеты «Linbro» (США)

Брико, 1997; Разработка ..., 2001]. Чувствительность

и нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор

их превосходит традиционные неинструментальные

0,45 мкм «Bio-Rad» (США), бычий сывороточный

аналоги (РНГА, РА, РСК, реакции иммунодиффу-

альбумин (БСА) «Sigma» (США), Sepharose CL-6B

зии). Таким образом,

аналитические

системы на

«Pharmacia Fine Chemicals» (Швеция), углеродный

основе углеродных диагностикумов являются пер-

диагностикум с G белком был изготовлен по ориги-

спективными для создания высокочувствительных

нальной методике [Плаксин, Раев, Громаковская,

неинструментальных скрининговых тест-систем для

1997] (приведена в разделе Методы).

диагностики сифилиса.

Буферные растворы: 0.15М раствор NaCl, забу-

Конструирование

твердофазных

тест-систем

ференный 0.015М Na-фосфатами, рН 7.25 (ЗФР);

требует оптимизации процедуры постановки анали-

ЗФР, содержащий 0.05% Твина-20 (ЗФРТ), 0,02 М

за, подбора экономичной и удобной для практиче-

карбонат-бикарбонатный буфер, pH 9,6 (КББ).

ского применения форматной аранжировки. Фунда-

ментом такой работы являются знания о кинетике

Методы

взаимодействия

отдельных

компонентов системы

Для проведения экспериментов по тестирова-

анализа, определение их наилучших концентраци-

онных соотношений, зависимости этих параметров

нию сконструированных иммуносорбентов синте-

от материала твердой фазы, природы антигена и т.д.

зировали диагностический реагент – конъюгат на-

Основой создания твердофазных аналитических

норазмерных частиц углерода с G белком стрепто-

систем является конструирование иммуносорбента

кокка. Частицы углерода выполняют функцию

– сенсибилизированной антигеном твердой фазы,

цветной метки, G белок определяет специфическое

готовой для проведения анализа. Особенности син-

взаимодействие частиц конъюгата с Fc фрагмента-

теза и структура твердофазного реагента являются

ми IgG высших млекопитающих. В ходе синтеза

одним из критических параметров, определяющих

использовали глутаровый альдегид для ковалент-

эффективность диагностической системы: ее чув-

ного связывания между собой сорбированных на

ствительность, наличие неспецифических реакций,

поверхности углеродных частиц молекул БСА на

воспроизводимость результатов анализа. Условия

первом этапе синтеза и добавляемых на втором

сорбции и оптимальные сенсибилизирующие кон-

этапе молекул G белка. Описанная система кова-

центрации антигена находятся в зависимости от его

лентных связей обусловливает прочность получае-

природы и от материала подложки.

мой конструкции и, как следствие, стабильность

Материалы твердой фазы обладают отличающи-

частиц конъюгата. Условная схема функционали-

мися механическими свойствами, сорбционной ем-

зированной частицы конъюгата представлена на

костью, величиной удельной поверхности, требуют

рис. 1.

применения различных буферных растворов для

Получение углеродного конъюгата с G белком

сенсибилизации; варьируют их устойчивость к из-

проводили, суспендируя 1 г аморфного углерода в

диагностикума. При этом конъюгат доводили до

ния пробы и конъюгата показало, что наивысшая

рабочего титра раствором исследуемого образца.

чувствительность системы анализа достигается

Помимо схемы внесения пробы варьировали

при сенсибилизации твердой фазы антигеном р17 в

длительность инкубации иммуносорбента с образ-

концентрациях 0.1 и 0.05 мг/мл и при длительно-

цом/смесью образца с конъюгатом: 15, 30, 60 мин.

сти инкубации ее с сывороткой более получаса.

Также сравнивали иммуносорбенты, полученные

Титр тестируемой сыворотки в этих случаях был

при различных сенсибилизирующих концентраци-

равен 1/3200. При меньшей длительности инкуба-

ях антигена: 0.1, 0.05, 0.01 мг/мл.

ции наблюдалось снижение чувствительности си-

В качестве исследуемой пробы использовали

стемы (рис. 2). Уменьшение концентрации сенси-

положительную референсную иммунную сыво-

билизирующего антигена до 0.01 мг/мл также нега-

ротку. Отрицательным контролем служила отрица-

тивно влияло на чувствительность системы анали-

тельная референсная сыворотка и ЗФРТ.

за, титр положительной сыворотки в этом случае

Тестирование иммуносорбентов на основе нит-

был менее 1/800.

роцеллюлозы в варианте последовательного внесе-

Специфичность аналитической системы при те-

Исследование свойств иммуносорбентов

стировании нитроцеллюлозных иммуносорбентов

на основе полистирола

в варианте последовательного внесения пробы и

Тестирование сенсибилизированных антигеном

диагностикума оставалась одинаково высокой не-

р17 T. pallidum производили по схеме последова-

зависимо от концентрации сорбируемого антигена

тельного и одновременного внесения пробы и диа-

и длительности инкубации с исследуемым образ-

гностикума. На дно каждой лунки полистирольно-

цом. Появления аналитического сигнала не было

го планшета сорбировали антиген в концентрациях

отмечено ни при использовании в качестве пробы

0.1, 0.05, 0.01 мг/мл, в каждую лунку вносили об-

контрольной отрицательной сыворотки, ни ЗФРТ.

разец в одном из разведений. Инкубацию иммуно-

При тестировании нитроцеллюлозных иммуно-

сорбента с пробой производили в течение 15, 30 и

сорбентов в варианте одновременного внесения

60 мин. Анализу подвергали положительную и от-

исследуемой пробы и диагностикума чувствитель-

рицательную сыворотки из референс-панели.

ность аналитической системы была значительно

При последовательном внесении объем пробы

ниже, чем при последовательной инкубации (менее

и конъюгата составлял 300 мкл, объём смеси при

1/200), независимо от концентрации антигена.

одновременном внесении диагностикума с образ-

Ложноположительных реакций выявлено не было.

цом также был равен 300 мкл.

pallidum р17 в системах с углеродным диагности-

Рос. Федерации. № 2089912; заявл. 10.09.1997 //

кумом продемонстрировали их перспективность

Бюл. «Изобретения». 1997. № 25. С. 336.

для конструирования систем диагностики сифили-

Раев М.Б. Способ защиты и стабилизации твердо-

са. Модельные аналитические системы на основе

фазных реагентов иммуноаналитических си-

исследованных твердофазных реагентов обладают

стем: пат. Рос. Федерации. № 2327992; заявл.

высокой чувствительностью и специфичностью.

27.06.2008 // Бюл. «Изобретения. Полезные мо-

Эти свойства критичны при разработке скрининго-

дели». 2008. № 18. С.785.

вых диагностических систем, особенно учитывая

Раев М.Б. Нанобиотехнологии в неинструменталь-

главную негативную черту существующих методов

ной иммуноаналитике / под. ред. В.А. Демако-

массовой диагностики – недостаточную чувстви-

ва. Екатеринбург: УрО РАН, 2012. 140 с.

тельность, предполагающую высокий процент по-

Раев М., Амбросов И., Брико Н. Новый метод для

тенциально ложноотрицательных результатов. По-

определения антител к Стрептококку гр. А.

лученные данные будут использованы при разра-

Streptococci and the Host. Ad. // Thea Horaud at al.

ботке системы серологической диагностики сифи-

Advances in Experimental medicine and biology. N.

лиса, определении условий и принципов ее хране-

Y.; London: Plenum Press, 1997. Vol. 418. Р. 327–

ния и эксплуатации.

329.

Разработка новых тест-систем для неинструменталь-

Работа выполнена при поддержке гранта 13-4-

ного определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. (Но-

016-ПЕРМ в рамках программы поддержки ориен-

вый биотехнологический подход к диагностике) /

тированных фундаментальных исследований УрО

М. Раев, Д. Плаксин, Н. Кеворков, В. Черешнев //

РАН.

Научно-технический потенциал Западного Урала

Библиографический список

в области конверсии военно-промышленного

комплекса. Пермь, 2001. С. 333–337.

О санитарно-эпидемиологической обстановке в

Реакция пассивной гемагглютинации в диагностике

сифилиса: возможности и горизонты применения

Пермском крае в 2011 году: гос. доклад /

в республике Беларусь / О.В. Панкратов, В.Г.

Управление Роспотребнадзора по Пермскому

Панкратов, Ю.В. Салук, И.В. Петрикина, А.П.

краю, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии

Карпович, И.П. Сысова // Сб. науч. тр. / Гос. учре-

в Пермском крае». Пермь, 2012. 272 с.

ждение «НИИ эпидемиологии и микробиологии».

Об утверждении протокола ведения больных сифи-

Минск: Белпринт, 2008. Вып. 1. С. 272–275.

лисом: приказ МЗ РФ №327 от 25 июля 2003.

Родионов А.Н. Сифилис. СПб.: Питер, 2007. 320 с.

Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Метод стерео-

специфического анализа и метод получения конъ-

Поступила в редакцию 23.12.2013

югата для стереоспецифического анализа: пат.