6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Статья_Тимганова_В_П_,_Бочкова_М_С_и_др_Исследование_стабильности

Одним из основных критериев, определяющим надежность диагностических тест-систем, является стабильность структурнофункциональных свойств их детектирующего реагента. Технология синтеза ферментных диагностикумов требует четкого соблюдения всех условий и режимов, отклонение от которых может приводить впоследствии к высокому уровню неспецифического связывания реагента с молекулами белков, не имеющих отношение к диагностическому результату, завышая, таким образом, детектируемое количество аналита [1]. Кроме того, ферментные конъюгаты требовательны к условиям хранения: заявленная большинством производителей сохранность реагентов составляет 6–12 месяцев. Нестойкость субстратов и продуктов конвертации также приводит к снижению надежности иммуноферментных тест-систем. В настоящее время разработано большое количество реагентов, в качестве метки которых выступают оптически плотные частицы. Недостатками методов, основанных на использовании в качестве меток латексных частиц, неметаллических коллоидов, оксидов металлов и т.д., является слабая стабильность диагностических реагентов, а также относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью используемых в качестве меток частиц. Конъюгаты углерода со стрептавидином, полученные авторским методом обладают рядом неоспоримых преимуществ, такими как высокая контрастность, чувствительность, простота в применении [2, 3].

Цель работы – исследование функциональной стабильности конъюгатов углерод-стрептавидин (С-Str), синтезированных с 1990 по 2012 годы.

Материалы и методы. Проверку чувствительности конъюгатов проводили в модельной тест-системе на пористой твердой фазе из нитроцеллюлозной мембраны с диаметром пор 0,45 мкм («Bio-Rad», США). На диски из мембраны диаметром 5 мм наносили дотами из капель по 3,5 мкл столбнячный анатоксин в концентрации 0,01 мг/мл в забуференном фосфатами физиологическом растворе с азидом натрия (PBS). С целью устранения неспецифического связывания диски инкубировали в блокирующем растворе (PBS с добавлением 1% казеина («Sigma»)). Далее следовала инкубация в 8 последовательных кратных двум разведениях кроличьих биотинилированных антител к столбнячному анатоксину, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. Детекцию проводили конъюгатами С-Str, синтезированными в 1990, 1992, 2002, 2009, 2010, 2012 годах. Результат оценивали визуально по черному окрашиванию зоны специфического связывания углеродного диагностикума.

Результаты и обсуждение. В процессе длительного хранения при t +4-8оС функциональные свойства конъюгатов C-Str не изменились, о чем свидетельствует одинаковая чувствительность детекции всех реагентов в прямом сравнении со свежесинтезированным диагностикумом (табл.).

Таким образом, pезультаты исследований подтверждают эффективность разработанной технологии получения стабильных углеродных

ЛИТЕРАТУРА

1.Nakane P.K. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation

/P.K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. – 1974. – V.22 (12). – P.1084 – 1091.

2.Плаксин Д.Ю., Раев М.Б., Громаковская Е.Т. Способ стереоспецифического анализа и способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа // Патент на изобретение РФ 20899212 от 10.09.1997.

3.Раев М.Б. Частицы коллоидного углерода в системах неинструментальной диагностики // Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. - № 2. – С. 45-48.

Timganova V.P., Bochkova M.S., Rayev M.B.,

Khramtsov P.V., Tyulenev A.V.

INVESTIGATION OF FUNCTIONAL STABILITY AMONG CARBON PARTICLEBASED DISGNOSTIC CONJUGATES DURING STORAGE

Abstract. Investigation of functional stability among carbon-streptavidin conjugates obtained according original author’s technology was carried out. It is revealed that the detection sensitivity of diagnostic reagents being synthesized within 20 years does not change its level and is similar to analytical characteristics of freshly synthesized conjugate that indicates high structural stability of carbon particle with its surface being functionalized at the expense of streptavidin.

Key words: carbon-streptavidin conjugate, non-enzyme diagnosticum, functional stability.

Авторская справка: Тимганова Валерия Павловна Бочкова М.С.

Раев М.Б. Храмцов П.В. Тюленев А.В.

Резюме: Проводили исследование различных параметров иммунной системы и уровней онкомаркеров у женщин с мастопатией. Выявлено, что у женщин с мастопатией в значительном проценте случаев выявляются повышенные уровни онкомаркеров, что создает условия для формирования в последующем у данной группы риска развития онкопатологии. Частота и выраженность изменений в иммунном статусе и уровнях онкомаркеров была высокой как у молодых женщин, так и женщин среднего возраста, что возможно обуславливает и постоянный рост уровня рака молочной железы у данной группы риска.

Ключевые слова: иммунологический мониторинг, иммунограмма, онкомаркеры.

Введение. В последнее десятилетие среди населения возрастает частота заболеваний, в основе которых лежат те или иные нарушения в иммунной системе, особенно это касается женщин репродуктивного возраста, уровень онкологических заболеваний которых неуклонно возрастает.

Ранее нами были выявлены характерные особенности состояния иммунной системы у больных с различными формами ИДС, аллергическими заболеваниями по сравнению с условно-здоровыми лицами [2, 3, 4, 5].

Материалы и методы. Иммунологические методы исследования включали специализированный осмотр врача аллерголога-иммунолога и лабораторную диагностику: оценку иммунного статуса, подсчет лейкоформулы с помощью гематологического анализатора «Beckman coulter» LH 500 (USA), определение фагоцитарной деятельности нейтрофилов, тест восстановления нитросинего тетразоля для оценки бактерицидности нейтрофилов, оценку лизосомальной активности фагоцитирующих клеток (нейтрофилов), определение количества популяций и субпопуляций лимфоцитов путем идентификации CD-молекул, c помощью проточного цитометра фирмы «Beckman coulter» FC500 (USA), определение концентрации иммуноглобулинов А, М, G турбидиметрическим методом на биохимическом анализаторе «Сапфир-400». Определение уровней онкологических маркеров (РЭА, СА 15-3, СА 19- 9, НСЭ, β-ХГЧ, АФП, СА-125) методом ИФА.

Статистическая обработка материала проводилась по расчету относительных и средних величин, их ошибки и достоверности различия, методами непараметрической статистики, с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows, 6.0» [1].

Результаты и обсуждение: Одной из причин проведения иммунологического обследования женщин явилась высокая онкологическая заболеваемость, особенно раком молочной железы, которая неуклонно растет, и среди причин смертности от онкопатологии вышла на второе место.

Нами было высказано предположение о том, что онкологическая заболеваемость может быть связана с нарушениями в иммунной системе. Для подтверждения данного предположения было проведено лабораторное обследование состояния иммунной системы и уровней онкомаркеров у иммуноскомпроментированных лиц.

Исследование показало, что у иммунологически скомпроментированных женщин с мастопатией выявляются повышенные уровни онкомаркеров. При этом надо отметить, что как у женщины в возрасте до 20 лет с патологией молочных желез, так у женщин в возрасте от 25 до 60 отмечаются более высокие уровни онкомаркеров (РЭА, СА 15-3, СА 19-9, НСЭ, β-ХГЧ, СА-125) по сравнению со здоровыми женщинами, не имеющими мастопатии и иммунологических нарушений. Что очень важно, у молодых женщин спектр повышенных онкомаркеров был выявлен выше, чем у женщин в возрасте 25-60 лет. Спектр выявленных повышенных онкомаркеров совпадает в изученных группах с больны-

ми раком молочной железы (7 в возрасте до 20 лет, 5 в возрасте 25-60 лет и 8 у больных раком молочной железы). У женщин с мастопатией и повышенными уровнями онкомаркеров наблюдались выраженные изменения иммунной системы, проявляющиеся в изменении уровней цитотоксических клеток, натуральных киллеров и фагоцитарных реакций, идентичных изменениям характерным для больных раком молочной железы.

Полученные данные свидетельствуют о правильности разработанного клинико-иммунологического подхода к выявлению группы риска с иммунологической заболеваемостью с одной стороны, и онкологической – с другой. Обращает на себя внимание тот факт, что у молодых женщин на фоне изменения параметров иммунной системы спектр и уровни онкомаркеров был выше, чем у женщин старшего возраста, что, по-видимому, создает предпосылки для развития рака молочной железы в более раннем возрасте.

ЛИТЕРАТУРА

1.Боровиков В. STATISTICA. Искусство анализа данных на компьютере: для профессионалов. (+CD). – СПб.: Питер, 2003. – 688с.

2.Определение параметров иммунной системы и уровней онкомаркеров у больных с различными синдромами иммунопатологии / Е.Б. Зуева, Т.А. Тиунова, В.А. Зурочка, А.В. Зурочка // Медицинская иммунология. - 2011. - Т.13, № 4-5. - С.456-457.

3.Зурочка А.В. Три этапа клинико-иммунологического мониторирования / А.В. Зурочка, Л.В. Рябова, А.С. Бастрон // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 1. - С.43.

4.Зурочка А.В. Методические подходы к оценке эффективности медико-социального иммунологического мониторинга при оценке состояния здоровья населения Урало-Сибирского региона / А.В. Зурочка, А.С. Бастрон // Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8, № 2-3. – С. 363.

5.Выявление онкомаркеров у иммуноскомпроментированных лиц по данным иммунологического мониторинга жителей городов Челябинской области / А.В. Зурочка, Е.Б. Зуева, Т.А. Тиунова, В.А. Зурочка

//Дни иммунологии в Сибири: материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Абакан, 2011. - С.97-99.

Tiunova T.A., Zueva E.B.

COMPRATIVE RESEARCH OF IMMUNE SYSTEM AND LEVELS ONCOLOGICAL MARKERS AT WOMEN OF VARIOUS AGE WITH MASTOPATIA AND A MAMMARY GLAND CANCER

Abstract. Carried out research of various parameters of immune system and levels the oncological markers at teenagers and women of reproductive age. It is revealed that at persons with immunopathology in considerable percent of cases the raised levels the oncological markers come to light that creates conditions for formation in the subsequent at the given group of risk of development of oncopathologies. Frequency and expressiveness of changes in the immune status and levels the oncological markers in Magnitogorsk was above, than in Chelyabinsk that probably causes also higher level of oncological disease in the given region.

Key words: immunological monitoring, immunogramm, the oncological markers.