6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Статья_Бочкова_М_С_,_Тимганова_В_П_,_Раев_М_Б_Решение_проблем_неспецифических

Иммуноаналитические методы занимают одно из ведущих мест практически во всех областях со временных медико биологических исследова ний. Они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, антитела, антигены и т.д.) в низких и очень низких концен трациях. Все соединения биологической приро ды, против которых возможно получение анти тел, могут быть выявлены этими методами. Твер дофазный иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид и др.). Как правило, он включает в себя несколько стадий, одна из которых – иммобилизация белко вых молекул (АГ или АТ и др.) на твердой поверх ности посредством пассивного и/или ковалент ного связывания. В процессе иммобилизации биомолекул (антилигандов) на поверхности твер дой фазы, особенно пористой, не все ее потенци альные сайты связывания оказываются заняты ми, что, как правило, приводит к неспецифиче скому взаимодействию других макромолекул, имеющихся в исследуемых образцах крови, (сы воротки, слюны и т.д.) с этими сайтами, и, следо вательно, искажает чувствительность и специ фичность полученных результатов [2]. Неспеци фическое связывание белков с твердофазной поверхностью может быть преодолено (миними зировано) посредством насыщения свободных сайтов связывания и/или нивелирования участия сил гидрофобного и электростатического взаимо действий блокирующими реагентами, которые представляют собой инертные вещества различ ной природы (белки и неионогенные детергенты) [3–5, 7]. Для исключения негативных реакций необходим тщательный подбор блокаторов и рас творителей для них. Таким образом, актуальным является выбор оптимальных блокирующих реа

гентов, исключающих все неспецифические вза имодействия, следствием которых является сни жение чувствительности и специфичности опре деления лигандов в системе твердофазного безынструментального дот иммуноанализа на по ристой твердой фазе с использованием углеродно го диагностикума.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Условная модель аналитической системы представлена на рис. 1.

Вкачестве основы твердофазного реагента ис пользовали диски из нитроцеллюлозной мембра ны диаметром 5 мм с размером пор 0.45 мкм (“Bio Rad”, США), на которые сорбировали в ви де точек специфичные к исследуемому веществу антилиганды и контрольные анти лиганды дота ми из капель по 5 мкл в концентрации 0.01 мг/мл

взабуференном фосфатами физиологическом растворе c азидом натрия (PBS).

Вкачестве антилигандов применили столб нячный анатоксин, термостабильный токсин Yersinia pseudotuberculosis (ТСТ), рекомбинант ный вирусоспецифичный белок env I ВИЧ I. По сле подсушивания диски инкубировали в течение 1 ч в восьми различных блокирующих реагентах: 1% казеин (“Sigma”, США); 1% й казеин (Рос сия); 1% й бычий сывороточный альбумин (БСА; США); 1% е сухое обезжиренное молоко (Фран

ция); 1% й гидролизат казеина (триптон, Испания); 1% й гидролизат казеина (“Bacto”, Германия); 1% й гидролизат казеина кислотный (Россия); PBS, со держащий 0.05% Tween 20 (PBS Tw); контроль без блокатора – PBS.

Промывку иммуносорбента осуществляли по средством PBS, после чего проводили инкубацию с лигандами: в системе со столбнячным анаток сином использовали противостолбнячные анти тела в концентрации 0.01 мг/мл, в случае с ТСТ мембраны инкубировали в сыворотке, содержа щей антитела к возбудителю псевдотуберкулеза в разведении 1 : 500. При иммобилизации на под ложку рекомбинантного вирусоспецифичного белка envI инкубацию проводили с сывороткой крови больного, инфицированного ВИЧ I. Длина серии разведений лигандов составляла 10 точек, с шагом, кратным двум. Для оценки специфичности тест системы в качестве внутреннего отрицатель ного контроля на поверхность иммуносорбента на носили бычий сывороточный альбумин в концен трации 0.01 мг/мл. Для внешнего отрицательного контроля мембрану с нанесенными антилиганда ми помещали в лунку с PBS. Положительным контролем служили иммуноглобулины G челове ка. Время инкубации составляло 30 мин, после чего мембраны промывали PBS и осуществляли детекцию конъюгатом белок G углерод в течение 15 мин. Для получения неферментных диагности кумов белок G ковалентно конъюгировали с части цами углерода по оригинальной авторской методи ке [1, 6]. Оценку результатов проводили визуально по черному окрашиванию зоны специфического связывания углеродного диагностикума. Для того чтобы исследовать влияние не только белковых блокаторов, но и неионогенного детергента – Tw 20 в качестве блокатора, анализ проводили в си стеме стандартного PBS без Tw 20 и стандартного PBS c 0.05% Tw 20, с помощью которых произво дилась промывка дисков и приготовление серий ных разведений лигандов и диагностикума.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные эксперименты по исследованию блокирующих свойств реагентов для дот имму ноанализа с применением углеродного диагно стикума позволили выявить ряд особенностей.

В системе по определению антител к столб нячному анатоксину без применения Tw 20 (рис. 2) такие блокирующие реагенты, как гидролизаты казеина различного производства, не устраняли неспецифическое связывание белков с несенси билизированной поверхностью иммуносорбента. Добавление 0.05% Tw 20 во все рабочие растворы исключало неспецифическую сорбцию прочих компонентов аналитической системы к твердо фазной поверхности иммуносорбента. В ходе анализа установили, что чувствительность систе мы детекции возрастает со 156 нг/мл в условиях без применения Тw 20 до 80 нг/мл при совмест ном использовании сухого обезжиренного моло ка и Тw 20. Это свидетельствует о том, что в си стеме, где нет существенной белковой нагрузки на подложку, можно использовать лишь неионо генный детергент, например Tw 20, который поз воляет исключить неспецифическое связывание белков с поверхностью иммуносорбента как в зо не инертной поверхности, так и в зоне специфи ческого связывания.

Аналогичные результаты были получены в мо дельной тест системе по определению антител к ТСТ Y. pseudotuberculosis (рис. 3). Наличие интен сивного фонового сигнала в системе без Tw 20 на блюдалось при использовании в качестве блокиру ющих агентов гидролизатов казеина различного производства, а также в контроле (стандартный PBS). В условиях совместного применения белко вых блокаторов и неионогенного детергента 0.05% Tw 20 наблюдалось полное отсутствие фо нового окрашивания, за исключением контроля, где блокирующие реагенты отсутствовали. Чув ствительность системы анализа в условиях ис пользования PBS без Tw 20 соответствовала раз ведению референсного образца в 16000 раз, а при добавлении Tw 20 возрастала до 32000 раз.

Вмодельной системе по определению антител

кВИЧ I (антигенным детерминантам гликопро теинов gp120 и gp41 вируса) несмотря на высокую белковую нагрузку на иммуносорбент получили результаты, аналогичные двум вышеуказанным модельным тест системам (рис. 4). Гидролизаты казеина, используемые без неионогенного детер гента Tw 20, не препятствовали неспецифиче ской сорбции прочих компонентов аналитиче ской системы в ходе анализа, что способствовало появлению интенсивного фонового окрашива ния иммуносорбента в зонах как специфическо го, так и неспецифического связывания. Добав ление Tw 20 способствовало отмене подобных эффектов. Чувствительность сконструированной аналитической системы в условиях применения стандартного PBS без Tw 20 соответствовала раз ведению сыворотки в 2000 раз, а добавление Tw 20 приводило к усилению специфического сигна ла в 2 раза (4000). Данные результаты позволяют утверждать, что в системе, где отсутствует неио ногенный детергент Tw 20, белковые блокаторы способствуют гашению не только неспецифиче ского, но и специфического сигнала, тем самым влияя на результативность тестирования.

Таким образом, результаты серии проведен ных исследований позволяют рекомендовать в качестве блокирующего реагента для твердофаз ного неферментного дот иммуноанализа с при

менением углеродного диагностикума неионоген ный детергент Tw 20 в оптимальной концентрации 0.05%, не вводя в систему защиты белковые ком поненты, традиционно применяемые для этих це лей. Структура диагностикума (пептизированные поверхности частиц) и Tw 20 справляются с нега тивными явлениями, связанными с возможным проявлением сил гидрофобного и электростатиче ского взаимодействий, неизбежно возникающими при контакте биологических макромолекул с син тетической поверхностью твердых фаз иммуно сорбентов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Плаксин Д.Ю., Раев М.Б., Громаковская Е.Т. Спо соб стереоспецифического анализа и способ полу чения конъюгата для стереоспецифического ана лиза. Пат. РФ № 20899212 // Бюл. Изобр. Полез ные модели. 1997. № 25.

2.Esser P. // Thermo Sci. Nunc. Bull. 2010. № 9. P. 1–4.

3.Esser P. // Thermo Sci. Nunc. Bull. 1990. № 8. P. 1–5.

4.Huber D., Rudolf J., Ansari P., et al. // Anal. Bioanal. Chem. 2009. V. 394. № 2. P. 539–548.

5.Morissette C., Goulet J., Lamoureux G. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. № 3. P. 836–842.

6.Rayev M., Shmagel K. // J. Immunol. Methods. 2008. V. 336. № 1. P. 9–15.

7.Vogt R.F., Phillips D.L., Henderson L.O., et al. // J. Im munol. Methods. 1987. V. 101. № 1. P. 43–50.