6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Практикум_по_физиологии_и_биохимии_растений_белки_и_ферменты_Ю_Ю
.pdfАктивность амилаз (АА) (в 1 мг гидролизованного крахмала за 1 ч на 1 мл ферментативного раствора) рассчитали по формуле:
АА = |
|
|
|
, |
|
|
где Ек и E0 - светопоглощение контрольного и опытного растворов, единиц шкалы прибора; 2 и 2—пересчетные коэффициенты на 1 ч и 1 мл ферментного раствора; 60 — пересчетный коэффициент на 1 мг крахмала (3 мл и 2%-го раствора соответствуют 60 мг) [Третьяков с соавт., 1990].
Материалы и обору ование. 1) спектрофотометр, центрифуга, ротатор, фарфоровые ступки с пестиками, водяная баня, колбы мерные емкостью 50 мл, 100 мл и 1л, конические колбы емкостью 100 мл, воронки, градуированные пипетки, пробирки;
2)1% NaCl; 0,2 н ацетатный буфер с рН 5,5; 2% раствор крахмала;
1н НСl; 0,1 н НСl;
3)проростки гороха, фасоли, ячменя, пшеницы или ржи.
Приготовление ацетатного буфера рН 5,5.
Для приготовления ацетатного буфера рН 5,5 необходимо взять
57,4 мл 1 н уксусной кислоты, прибавить 50,0 мл 1 н раствора NaOH и разбавить полученный раствор до 500 мл дистиллированной водой.
Опре еление активности протеиназ в прорастающих семенах
Протеолитические ферменты, протеазы, пептид-гидролазы – это ферменты класса гидролаз; содержатся во всех живых организмах, катализируют гидролиз пептидных связей в клеточных белках и белках пищи. Протеолитические ферменты делят на пептидазы (экзопептидазы) и протеиназы (эндопептидазы). Пептидазы гидролизуют преимущественно внешние пептидпые связи в белках и пептидах, протеиназы – внутренние. В зависимости от особенностей строения активного центра протеолитические ферменты подразделяют на сериновые, тиоловые (цистеиновые), кислые протеиназы и металлоферменты, содержащие в активном центре атом металла (чаще Zn). К металлоферментам относится большинство известных пептидаз. Протеиназы различают также по субстратной специфичности, т. е. способности гидролизовать связи между определёнными аминокислотными остатками.
В растениях протеолитические ферменты содержатся как в вегетативных органах - листьях, стеблях, корнях, так и в покоящихся и
31
прорастающих семенах. Протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в растительных организмах, начиная с переваривания запасных белков семян до специфических регуляторных процессов, таких, как активация зимогенов, образование гормонов и других, биологически активных пептидов из их предшественников, транспорт белков, защитные реакции.
Принцип мето а. В основу определения суммарной активности протеиназ положен метод, разработанный Ансеном и заключающийся в том, что ферментным препаратом, выделенным из растительного материала (семядолей прорастающих семян гороха, фасоли, бобов или прорастающих зерновок пшеницы и ржи), действуют на раствор какоголибо очищенного белка (казеина, альбумина, гемоглобина). Ферментную активность определяют по количеству высвободившихся из белков ароматических аминокислот (тирозина, триптофана) после удаления из раствора непрореагировавших с протеиназами белков и ферментного препарата.
Количество ароматических аминокислот, содержащихся в низкомолекулярных белках, пептидах и в свободном состоянии, определяют колориметрически с реактивом Фолина или на спектрофотометре при 280 нм. Принято считать (с определенной степенью условности), что активность протеиназ пропорциональна содержанию в растворе ароматических аминокислот.
Свойства белков, положенные в основу данного метода, служат хорошей иллюстрацией групповой специфичности протеиназ, заключающейся в том, что фермент катализирует расщепление определенных химических связей в отдельных группах близких; по строению веществ (протеиназы растений гидролизуют и белок животного происхождения).
Поря ок работы. Выделение протеиназ. Взвешивают 4-5 г сырых семядолей или зерновок (навеска сухого материала около 1 г), помещают в ступку, добавляют немного кварцевого песка и тщательно растирают. Приливают 5 мл дистиллированной воды и продолжают растирание до получения мелкодисперсной гомогенной кашицы. Навеску количественно переносят в мерную колбу на 50 мл, ополаскивая пестик и ступку небольшими порциями воды. Объем жидкости в колбе доводят до 50 мл, суспензию перемешивают и оставляют настаиваться в течение 1 ч (периодически перемешивая) при
2-5 °С.
32
Рекомендовано к изучению разделом по биологии сайта https://meduniver.com/
Затем содержимое колбы переносят в центрифужные пробирки (две пробирки по 20 мл), уравновешивают их и вытяжку центрифугируют в течение 30 мин при 8000-10000 g. После этого надосадочную жидкость сливают в чистую колбу (препарат протеиназ) с притертой пробкой и при необходимости ставят в холодильник. Работу по определению активности протеиназ лучше проводить со свежим препаратом.
Приготовление растворов субстратов. В качестве субстратов для определения активности растительных протеиназ используют 2%-е растворы химически чистых препаратов казеина, альбумина или гемоглобина. Протеолитическая активность ферментов в семядолях двудольных и зерновках злаков обусловлена действием нескольких протеиназ, специфичных для каждого вида растений. Для функционирования отдельно взятой протеиназы необходимы специфические условия, в том числе и определенная реакция среды. Поэтому активность растительных протеиназ определяют при одинаковых температурном режиме и соотношении субстрат : фермент по массе, но при различных значениях pH.
Приготовление раствора казеина. Взвешивают 2 г порошка казеина, помещают в мерную колбу на 100 мл, приливают небольшими порциями, ополаскивая стенки воронки и горлышка колбы, около 80 мл 0,2 М фосфатного буфера с pH 8.0. Для растворения навески колбу ставят на водяную баню, нагретую до 30-40 °С. После растворения казеина содержимое колбы доводят буферным раствором до метки и тщательно перемешивают. Затем в отдельный стаканчик отливают 10 мл раствора и в нем проверяют pH. При необходимости доведения pH до заданной величины добавляют при интенсивном перемешивании несколько капель 1 н NaOH или 1 н НС1 (по каплям). Затраченное количество щелочи или кислоты учитывается, и соответствующее их количество вносят в раствор казеина, оставшийся в колбе. Раствор субстрата вновь перемешивают.
Приготовление раствора гемоглобина с рН 3.0. Помещают 2 г
порошка гемоглобина в фарфоровую ступку, приливают около 10 мл воды и тщательно растирают, строго следя, чтобы не было комочков и часть белка не осталась на стенках ступки и головке пестика. Затем раствор количественно переносят в стаканчик на 50 мл. Небольшой порцией воды ополаскивают ступку, пестик. Раствор гемоглобина в стаканчике подкисляют 0,3 н. HCI до pH 3.0, количественно переносят в
33
мерную колбу на 100 мл, доводят содержимое колбы до метки водой и тщательно перемешивают.
Приготовление раствора гемоглобина с рН 6.0. Помещают 2,2 г
порошка гемоглобина в колбу на 150 мл и заливают 100 мл 1/15 М фосфатного буфера с pH 6.0. Колбу плотно закрывают пробкой и ставят в ротатор для перемешивания и растворения содержимого. После того как гемоглобин растворится (через 15-20 мин), колбу снимают с ротатора, вынимают пробку, в раствор вносят 36 г мочевины и оставляют при комнатной температуре на 30-40 мин, периодически перемешивая. После растворения мочевины в отдельно взятой пробе проверяют pH и при необходимости доводят до pH 6.0 растворами 1 н NaOH или 1 н НС1.
Определение активности протеиназ. В центрифужные пробирки на 10 мл, пронумерованные по порядку, наливают по 2 мл растворов субстратов: казеина с pH 8.0 или гемоглобина с pH 3.0 и pH 6.0, после чего пробирки помещают на 1...2 мин на водяную баню, предварительно нагретую до 30 оС. Когда раствор субстрата примет температуру бани, в пробирки вносят по 2 мл ферментного препарата, полученного из семян той или иной культуры в соответствии с заданием преподавателя. Реакция гидролиза белков идет 30 мин при 30 °С. Для равномерного прогревания содержимого пробирки периодически осторожно встряхивают.
Через 30 мин действие протеиназ останавливают добавлением в реакционную смесь 4 мл 10 %-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК).
В трех пробирках готовят контрольные образцы. Для этого в них вносят по 2 мл соответствующих растворов субстратов (растворы казеина и гемоглобина с различными pH) и помещают на водяную баню.
Через 2 мин добавляют по 2 мл ферментативного препарата, встряхивают и вслед за этим в каждую приливают по 4 мл 10 %-го раствора ТХУК. Все остальные операции проводят, как и в опытных вариантах.
Пробирки с опытными растворами встряхивают и оставляют на водяной бане еще 30 мин для более полного осаждения непрореагировавших с протеиназами белков и самих ферментов. Пробирки снимают с водяной бани, осторожно насухо вытирают и уравновешивают на рычажных лабораторных весах, добавляя при
34
Рекомендовано к изучению разделом по биологии сайта https://meduniver.com/
необходимости в более легкие несколько капель 5 %-го раствора ТХУК. Затем пробирки помещают в ротатор центрифуги, центрифугируют 15 мин при 5000 g, ставят в штатив и приступают к спектрофотометрированию надосадочной жидкости. Параллельно определяют содержание белков в колбе, где находится ферментный препарат (так же, как суммарные белки в растительном материале). В качестве эталонного раствора берут дистиллированную воду. При определении измеряют светопоглощение и раствора субстрата. Спектрофотометрирование растворов проводят при 280 нм.
Активность протеиназ (АП) в условных единицах на 1 г навески за
1 ч рассчитывают по формуле:
( )
где Ек и Ео – светопоглощение контрольного и опытного образцов; А1 – навеска материала, соответствующая количеству ферментного
препарата, взятого для определения (А1 = |
|
, где А – навеска |
|
материала, взятая для анализа, г), г; 2 – коэффициент пересчета на 1 ч. Материалы и обору ование. 1) спектрофотометр, центрифуга,
ротатор, фарфоровые ступки с пестиками, водяная баня, колбы мерные емкостью 50 мл, 100 мл и 1л, конические колбы емкостью 100 мл, воронки, градуированные пипетки, пробирки;
2)казеин, гемоглобин, 0,2 М фосфатный буфер с pH 8.0, 1/15 М фосфатный буфер с pH 6.0; растворы 0,3 н НСl, 1 н NaOH, 5 %-й и 10 %-
йТХУК, 1 н НСl; мочевина.
3)проростки и проросшие семена гороха, фасоли, пшеницы или ржи, мука злаковых.
Приготовление 1/15 М фосфатного буфера рН 6.0.
Раствор А: 1/15 М Na2HPO4 2Н2O (11,866 г в 1 л)
Раствор В: 1/15 М КH2PO4 (9,073 г в 1).
Буфер готовится смешиванием 12,1 мл раствора А + 87,9 мл раствора В.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Большой практикум по биоэкологии. Ч. 1: Учеб. пособие /
О.Л. Воскресенская, Е.А. Алябышева, М.Г. Половникова. – ЙошкарОла, Изд-во: Мар. гос. ун-т. - 2006. – 107 с.
35
2. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. T. 46. C. 321–336.
3.Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологи растений / Вл.В. Кузнецов, В.В. Кузнецов, Г.А. Романов. – М.: Бином. Лаборатория знаний, 2011. – 487 с.
4.Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - М.: Колос, 1976. -
256с.
5.Практикум по физиологии растений / Н.Н. Третьяков, Т.В. Карнаухова, Л.А. Паничкин. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.
6.Практикум по росту и устойчивости растений / В.В. Полевой, Т.В. Чиркова, Л.А. Лутова и др. – СПб.: Изд-во С.Петеррб. ун-та, 2001. -
212с.
7.Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Мошков И.Е. Количественное определение содержания белка // Физиология растений. 2011. Т.58.
С.624-630.
8.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
9.Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
10.Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid // Anal. Biochem. 1985. V. 150. P. 76-85.
11.Gornall A.G., Bardawill C.S., David M.M. Determination of Serum Proteins by Means of the Biuret Method // J. Biol. Chem. 1949. V. 177. P. 751-766.
12.Wiechelman K.J., Braun R.D., Fitzpatrick J.D. Investigation of the Bicinchoninic Acid Protein Assay: Identification of the Groups Responsible for Color Formation // Anal. Biochem. 1988. V. 175. P. 231-237.
13.Layne E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins // Methods Enzymol. 1957. V. 3. P. 447-455.
14.Fasman G.D. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Boca Raton: CRC, 1989. 601 p.
15.Stoscheck C.M. Quantitation of Protein // Methods Enzymol. 1990. V.
182. P. 50-68.
36
Рекомендовано к изучению разделом по биологии сайта https://meduniver.com/