5 курс / Госпитальная педиатрия / 1 том Респираторная медицина

Неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы (НФМО). Среди микроорганизмов, вызывающих инфекцию у больных МВ, значительное место занимают грамотрицательные НФМО, общими признаками которых являются природная устойчивость ко многим антибиотикам, высокая резистентность к дезинфектантам и распространение в больничных стационарах от больного к больному с помощью рук и выделений медицинского персонала. Грамотрицательные неферментирующие бактерии принадлежат к нескольким родам и условно могут быть разделены на оксидазоположительные — роды Pseudomonas, Burkholderia, Achromobacter, Moraxella, Stenotrophomonas, группу бактерий WO-1 (weak oxidizer) со слабой оксидазной активностью, группу 2 Pseudomonas-подобных бактерий и оксидазоотрицательные — род Acinetobacter, виды Chryseomonas luteola и Flavimonas oryzihabitans [17].

Синегнойная палочка. Род Pseudomonas (sensu stricto) включает 11 видов: Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. veronii, P. monteilii, P. stutzeri, P. mendocina, P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. luteola, P. оryzihabitans. Для больных МВ наиболее значимым является Pseudomonas aeruginosa.

Типичные изоляты синегнойной палочки идентифицируют по таким свойствам, как пигментообразование, положительный тест на оксидазу, рост при 42 °С, характерный земляничный запах, рост на цетримидном агаре. При этом от больных МВ с хронической синегнойной инфекцией часто изолируют атипичные формы P. aeruginosa, которых трудно идентифицировать без применения молекулярно-генетических методов (ПЦР) [32].

При исследовании образцов мокроты от больных детей за 2012–2013 гг. бактерии P. aeruginosa были выделены у 51 ребенка (30,5%). При этом у 25 детей была изолирована P. aeruginosa с мукоидным фенотипом, который характерен для хронической синегнойной инфекции легких. У 10 детей выделяли мукоидный и немукоидный фенотипы одновременно. От 16 детей были идентифицированы штаммы с немукоидным фенотипом. Мукоидные штаммы при хронической инфекции резистентны к защитной системе организма и лечению антибиотиками, что обусловлено наличием таких факторов патогенности, как альгинат и рамнолипид, продукцию которых регулирует система Quorum Sensing, ответственная, кроме синтеза ряда факторов патогенности, за образование биопленки [33]. Развитию хронической синегнойной инфекции предшествует инфицирование меняющимися штаммами P. aeruginosa, при этом штаммы отличаются друг от друга. Установление хронической инфекции происходит благодаря образованию биопленок и адаптации в легких больных МВ штаммов: штаммы переходят в мукоидную форму, становятся гипермутабельными и, соответственно, резистентными к антибиотикам [34]. Поэтому дополнительными

методами исследования хронической синегнойной инфекции у больных МВ могут быть изучение способности образовать биопленку и выявление гипермутабельных штаммов.

Первичную синегнойную инфекцию можно вылечить с использованием больших доз антибиотиков в течение длительного периода времени, в связи с этим очень важно своевременно установить диагноз синегнойной инфекции. Согласно нашим исследованиям [2], в группе детей до 1 года у 19% встречается P. aeruginosa, а в возрасте 5–7 лет P. aeruginosa встречается уже у 31,2% детей. С возрастом процент высева P. aeruginosa увеличивается.

Таким образом, учитывая колонизацию дыхательных путей P. aeruginosa в раннем детском возрасте, необходимо осуществлять мониторинг микрофлоры сразу после постановки диагноза «муковисцидоз».

Achromobacter spp. — оппортунистический патоген, оксидазо- и каталазоположительный грамотрицательный НФМО. Обладает природной резистентностью ко многим антибиотикам. В последнее время хроническая инфекция легких, вызванная A. xylosoxidans и A. ruhlandii, у больных МВ встречается часто. Согласно последним данным наиболее часто выделяется A. ruhlandii, второй по частоте встречаемости A. xylosoxidans, который при исследовании образцов от больных детей за 2012–2013 гг. выделяли в 9% случаев [4].

Очень часто Achromobacter spp. ложно диагностируют как В. cepacia complex в связи с фенотипическим сходством с B. cepacia complex при культивировании на 5% кровяном агаре и ростом на BCSA — селективной для Всс среде. Для подтверждения принадлежности бактерии к видам

A.ruhlandii, A. хylosoxidans и другим необходимо использовать тест системы API 20NE (BioMerieux ) и ПЦР для выявления локуса в 16S рДНК со специфическими праймерами AX-F1 и AX-B1 [23].

Burkholderia cepacia complex (Всс). В настоящее время Всс включает 20 видов микроорганизмов:

B.cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis,

B.vietnamiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. pyrrocinia,

B.anthina, B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris,

B.seminalis, B. metallica, B. contaminans, B. lata, B. pseudomultivorans, B. stagnalis, B. territorii [35]. Точная идентификация неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов от больных МВ является наиболее сложной задачей. Очень часто нетипичные по фенотипическим свойствам микроорганизмы ошибочно могут диагностироваться как другие виды микроорганизмов. Ложная идентификация P. aeruginosa или Bcc могут иметь нежелательные последствия, ведущие к выбору неправильной терапии и изоляции пациентов.

Например, 2 штамма атипичной P. aeruginosa и 2 штамма A. xylosoxidans были неправильно идентифицированы API 20NE как Всс, 12 штаммов Bcc биохимическими тестами (LaChema) были непра-

вильно идентифицированы как другие НФМО. Около 3,4% штаммов биохимическими тестами не удалось идентифицировать вообще. Для окончательной точной идентификации были использованы молекулярно-генетические методы. Kiska et al. показали в своей работе, что точность идентификации НФМО 4 различных коммерческих тест-систем составляет 57–80%, а точность идентификации Всс — 43–86%. При этом все тесты идентифицировали НФМО, не являющиеся Всс, как Всс [36]. Wellinghausen et al. сравнивали результаты идентификации с помощью API 20NE 88 грамотрицательных оксидазоположительных палочек с результатами секвенирования 16S rRNA. Точность идентификации составляла 17%. В связи с этим методы, основанные на ПЦР, в частности real-time ПЦР, могут быть незаменимыми в сложных ситуациях.

В последнее время для точной идентификации используют метод MALDI-TOF и конечно мультилокусное секвенирование и полное секвенирование генома.

Микроскопический метод. Изучение нативных и окрашенных препаратов, в том числе с использованием меченных флюорохромом специфических антисывороток (антительные диагностикумы), обеспечивает быструю диагностику инфекций НДП.

Под большим увеличением (иммерсионный объектив ×100) изучают морфологию бактерий. Чувствительность микроскопического метода при окраске по Граму, по разным оценкам, варьирует от 35 до 96%, а специфичность — от 12 до 85% [37]. Его диагностическое значение в основном ограничивается пневмококковой инфекцией, где совпадение с результатами культуральной диагностики составляет 75% [38].

Для выявления Mycobacterium tuberculosis микроскопические методы при окраске мазков по Цилю–Нильсену и флюоресцентным красителем имеют одинаковую чувствительность (до 50%)

испецифичность (до 99%) [39]. Для обнаружения МБТ в световом микроскопе при окраске по Цилю–Нильсену необходимо содержание в мокроте не менее 5000–10 000 КОЕ/мл.

При диагностике актиномикоза легких материалом для микроскопического исследования служат гной, мокрота, плевральная жидкость, пунктаты закрытых очагов поражения, биопсийный материал. Обнаружение друз, мицелия, отдельных веточек и цепочек из спор — ценное подтверждение актиномикотической природы болезни. Прямая фазово-контрастная микроскопия бронхиального секрета со смесью 10% раствора калия гидроксида

и10% глицерина позволяет проводить быструю идентификацию грибов Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans и Aspergillus spp., добавление специальных красителей позволяет улучшить очертания элементов гриба, включая P. jiroveci. Для определения антигенов P. jiroveci в индуцированной мокроте и БАС мож-

но использовать реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) с моноклональными АТ [40].

Для обнаружения Legionella pneumophila непосредственно в мокроте, ТТА, бронхиальном смыве, биоптатах ткани легкого применяется реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ), чувствительность которой составляет 25–66%, специфичность достигает 94% [41]. Для постановки диагноза «легионеллезная пневмония» положительный результат РИФ требуется подтвердить любым другим методом: культуральным исследованием респираторных образцов, либо определением антигена в моче, либо серологическими реакциями с сывороткой крови больного.

РИФ позволяет диагностировать инфекции, вызванные РС-вирусом, вирусами гриппа А и В, парагриппа, аденовирусами, вирусом кори, что особенно важно в случаях, когда обычная вирусологическая технология трудоемка или недоступна.

Методы выявления антигенов. Определение антигенов широко используется для диагностики различных инфекций, что связано с возможностью быстрого получения результатов и идентификации некультивируемых возбудителей. Однако для правильного диагноза недостаточно использование одного метода. Надежность теста в большей степени зависит от того, может ли возбудитель быть комменсалом (как в случае с Streptococcus pneumoniae), или его наличие всегда свидетельствует об инфекции (например, Legionella pneumophila) [42, 43].

Для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae в мокроте, сыворотке крови и моче были разработаны методы встречного иммуноэлектрофореза, коагглютинации, латекс-агглюти- нации, ИФА. Их чувствительность варьировала от 40 до 90% [44, 45].

При диагностике легионеллезной пневмонии рекомендованы ИФА и радиоиммунологический метод для выявления в моче антигенов L. pneumophila серогруппы 1, на долю которой приходится 70–90% всех наблюдений болезни легионеров. Их чувствительность достигает 70–100%, специфичность — больше 99% соответственно [46]. Разработан иммунохроматографический тест для определения легионеллезного антигена в моче.

При криптококкозе определяют наличие антигена Cryptococcus neoformans в БАС, плевральном экссудате, сыворотке крови и ликворе [47], а при аспергиллезе используют ИФА для выявления в сыворотке крови белкового антигена (галактоманнана), превалирующего в клеточной стенке Aspergillus spp. [48]. При легочном бластомикозе

всыворотке крови, моче и БАС можно выявить антиген Blastomyces dermatidis у 70–100% больных

взависимости от формы инфекции (локализованная или генерализованная) [49].

Вназофарингеальном аспирате, лаважной жидкости и мокроте в инфицированных эпителиальных клетках с помощью РИФ и ИФА можно быстро обнаружить антигены вирусов гриппа,

парагриппа, аденовирусов, ЦМВ в ранние сроки заболевания.

Диагностика микобактерий. После разжижения мокроты и центрифугирования из осадка производят высевы на яичную среду (Левенштейна– Йенсена) или агаровую основу (среда Миддлбрука 7Н10). Селективные среды содержат ингредиенты, тормозящие рост сопутствующих бактерий и грибов. Инкубацию проводят во влажной атмосфере с содержанием 8–12% диоксида углерода. Образцы можно инокулировать в жидкую среду

с14С-пальмитиновой кислотой с добавлением

или без антимикробных агентов, используя радиометрический метод и аппарат BACTEC 480TB. Чувствительность этого метода достигает 10 КОЕ/мл. Для получения роста МБТ на первичных средах требуется 3–5 нед инкубации, затем еще 1–2 нед для подтверждающего ниацинового теста и определения чувствительности к антитуберкулезным препаратам. В среднем исследование с применением радиометрического метода занимает 18 дней, обычным методом — 36 дней [50].

Диагностика аэробных актиномицетов. Аэробные патогенные актиномицеты включают роды

Nocardia, Streptomyces, Actinomadura и Rhodococcus, Micromonospora, Micropolyspora, Thermoactinomyces

и Saccharomonospora. Они вызывают пневмониты (альвеолиты) и хорошо растут (в течение 3–7 дней) на простых бактериальных и грибковых средах при 50 °С во влажной атмосфере. Однако у рода Nocardia для роста колоний может потребоваться 3 нед инкубации. Идентификацию актиномицет проводят по морфологическим признакам колоний, микроскопическому строению микроорганизмов, способности гидролизовать различные субстраты, взаимодействию чистых культур с антительными диагностикумами в серологических реакциях.

Диагностика грибов. Лабораторную диагностику пневмомикозов проводят культуральным, гистологическим и серологическими методами. Для посева используют картофельные среды, сабуродекстрозный агар, агар на сердечно-мозговой вытяжке, также селективные среды, содержащие хлорамфеникол и гентамицин, иногда с добавлением циклогексимида, подавляющего рост быстрорастущей плесени и ингибирующего C. neoformans,

Aspergillus fumigatus и некоторые виды Candida. В отличие от бактерий, которые культивируют при 35 °С, посевы грибов инкубируют при 30 °С.

Грибы рода Candida часто обнаруживают в БАС, но они редко бывают истинными возбудителями инфекций нижних дыхательных путей. При исследовании аутопсийной ткани легких гистологическое подтверждение кандидоза было выявлено лишь у 2% онкологических больных и у 0,5% пациентов без неопластических процессов. Определение кандидозного антигена непосредственно в сыворотке крови или клинических образцах мало помогает в диагностике локального

или диссеминированного кандидоза, поскольку чувствительный метод ИФА выявляет присутствие антигенов и АТ у здоровых и у 50–75% больных при диссеминированном кандидозе [40, 51].

Инвазивный легочный аспергиллез встречается чаще, чем легочный кандидоз, в 90% наблюдений выделение аспергилл из мокроты и бронхиального смыва связано с колонизацией НДП [52]. В то же время при подтвержденном инвазивном легочном аспергиллезе лишь у 10% больных из мокроты были выделены Aspergillus spp. Для правильной интерпретации результатов культуральной диагностики необходимо производить посевы двух образцов, полученных при транстрахеальной легочной биопсии и методом защищенной щеточной биопсии [53]. Для ранней диагностики инвазивного легочного аспергиллеза может быть полезным обнаружение аспергиллезного антигена в сыворотке крови методом ИФА, чувствительность которого варьирует в пределах 60–100% в разных группах больных [54].

Выделение C. neoformans из респираторного тракта следует трактовать с осторожностью, так как в половине наблюдений у пациентов отсутствуют признаки поражения паренхимы легких, рентгенологические изменения и другие симптомы заболевания. Это свидетельствует лишь о колонизации грибами [55]. Для подтверждения диагноза «криптококкоз» помогает обнаружение криптококкового антигена в сыворотке крови

иликворе. Антиген можно определять также в плевральном выпоте и БАС [47].

Неопределенность в оценке положительных

иотрицательных результатов посевов при диагностике оппортунистических грибковых инфекций возрастает у больных иммунодефицитами. Существует два наиболее достоверных критерия прижизненной диагностики таких инфекций: 1) обнаружение грибов в ткани легких при культуральном или гистологическом исследовании; 2) выделение культуры при посеве ликвора или других стерильных жидкостей тела, исключая кровь и мочу, которые могут контаминироваться, в том числе при заборе материала [56].

Вотличие от оппортунистических возбудителей пневмомикозов, выделение патогенных диморфных грибов Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis и Sporothrix schenckii из респираторных образцов, ткани легких и биоматериалов других локализаций имеет несомненную клиническую значимость. Эти грибы существуют в мицелярной и дрожжевой (или в виде сферул) формах. В среднем их рост на средах появляется через 14 дней (грибов рода Candida — через 1–3 дня, Aspergillus spp. — через 4–7 дней). В рутинной практике посевы инкубируют до 4 нед у пациентов при серологически подтвержденной грибковой инфекции или у больных, получавших антигрибковую терапию при неустановленной этиологии

инфекционного процесса. Присутствие орофарингеальной микрофлоры в респираторных образцах не препятствует интерпретации результатов посевов на диморфные грибы. Посевы осуществляют при отрицательных результатах прямой микроскопии окрашенных препаратов, в том числе специальными методами, где можно легко идентифицировать соответствующий возбудитель по характерной морфологии. При диссеминированной грибковой инфекции исследуют материалы из других анатомических областей. Например, при генерализованном гистоплазмозе прямая микроскопия окрашенных мазков костного мозга помогает быстро поставить диагноз у 50% больных, положительный посев обнаруживается в 84% наблюдений [57]. Дополнительный диагностический тест — обнаружение полисахаридного антигена H. capsulatum в моче методом ИФА у 90% больных, однако этот тест может быть положительным и

упациентов с диссеминированной инфекцией, вызванной P. brasiliensis, В. dermatidis, Penicillium marneffei [58].

Диагностика хламидий. У детей хламидийную пневмонию, вызванную Chlamydia trachomatis, можно диагностировать методом РИФ, культуральным и серологическими методами. Для посева обычно используют гетероплоидные мышиные клетки МакКой, обработанные циклогексимидом, которые инкубируют 40–72 ч, после чего исследуют наличие внутриплазматических включений хламидий при световой микроскопии после окрашивания иодином гликогена, продуцируемого хламидиями в инфицированных клетках. Более быстрый и чувствительный метод — РИФ при окраске культуры клеток моноклональными АТ.

C. psittaci не продуцирует гликоген, и ее внутриплазматические включения выявляют при окраске по Гимзе обычно после 5–10 дней инкубации. Поскольку клеточные культуры C. psittaci высокоинфекционные, метод культивирования используется редко, и диагноз пситтакоза устанавливают серологическими методами.

C. pneumoniae можно обнаружить при заражении респираторными образцами монослоя культуры клеток HeLa-229. После инкубации в течение 3–5 дней готовят окрашенные специфическими моноклональными АТ препараты и изучают методом РИФ.

Диагноз хламидийной пневмонии ставят серологическими методами при определении АТ. Однако

убольных иммунодефицитами, неспособными синтезировать в достаточном количестве АТ, может потребоваться культуральное исследование или использование молекулярно-генетических методов. Из трех видов хламидий C. trachomatis — редкий возбудитель ВП у больных иммунодефицитами.

Определение чувствительности хламидий к антибиотикам не имеет существенного значения, так как различия между штаммами и появление новой резистентности весьма редки, сами методы опре-

деления не стандартизированы и используются в основном с научной целью [1, 59, 60].

Диагностика микоплазм. Среды для культивирования микоплазм содержат свежий дрожжевой экстракт, пептон, сыворотку животных и готовятся как двухфазная среда с агаровой основой, залитой бульоном, содержащим индикатор рН для контроля ферментации глюкозы, бензилпенициллин и ацетат таллия для подавления роста бактерий. Другие добавки включают амфотерицин В и полимиксин. В процессе инкубации посевов наблюдают появление помутнения среды в течение 4–6 дней, после чего производят первый высев на селективный агар, затем повторный высев на 8–12-й день. Рост типичных колоний обычно виден в конце 2-й недели инкубации, при отсутствии роста двухфазную среду инкубируют до 30 дней, после истечения этого периода выдают отрицательный результат. Разрешающая способность культурального метода 105 КОЕ/мл, при прямом определении антигена в респираторном секрете методом ИФА — 104 КОЕ/мл. Из-за медленного роста организмов и низкой чувствительности культурального метода (60%) для диагноза инфекции M. pneumoniae чаще используют определение специфических АТ или ДНК-амплификационный тест [1, 59, 60].

Чувствительность микоплазм к антимикробным препаратам определяют только в научных целях и при изучении новых препаратов. Как и хламидии, они предсказуемо чувствительны к тетрациклинам, макролидам, кетолидам и фторхинолонам.

Диагностика вирусов. Для заражения вирусами используют разные культуры клеток, возникновение инфекции определяют по цитопатическому эффекту или появлению гемагглютинирующих антигенов. Дополнительные тесты (гемадсорбции, ингибиции гемагглютинации, нейтрализации и иммунофлюоресценции) используют для дифференциации вирусов гриппа и парагриппа. Культуральный метод при изучении респираторных образцов более чувствительный, чем определение антигенов, и занимает в среднем 3–4 дня для обнаружения цитопатического эффекта при вирусе гриппа А и 8–9 дней при ЦМВ.

Выделение вирусов гриппа, парагриппа, РСвирусов и риновирусов из респираторных образцов и ткани легкого имеет одинаково важное клиническое значение, в отличие от аденовирусов, вирусов простого герпеса и ЦМВ, обнаружение которых в респираторных образцах не столь существенно, как в ткани легкого [1, 59, 60].

Серодиагностика. Серодиагностика основана на выявлении специфических АТ разных классов иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) в сыворотке крови у инфицированных пациентов и определении их титров при однократном исследовании или в динамике заболевания (в парных сыворотках, взятых с интервалом 10–14 дней) с помощью

антигенных диагностикумов в различных серологических реакциях in vitro. Обычно используются реакции преципитации, агглютинации, встречного иммуноэлектрофореза, ИФА, непрямой иммунофлюоресценции, РСК. Эти методы имеют основное значение при подтверждении диагноза

ипроведении эпидемиологических исследований. Известны коммерческие наборы на основе

ИФА и реакции непрямой иммунофлюоресценции для определения IgM АТ и IgG АТ к широкому кругу респираторных патогенов: Legionella spp.,

Francisella tularensis, Yersinia pestis, M. pneumoniae, C. pneumoniae, C. psittaci, Coxiella burnetii, T oxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Strongiloides stercoralis, вирусов гриппа, парагриппа, РС-вирусов, аденовирусов, ТОРС-коронавирусов, вирусов простого герпеса, ЦМВ, вирусов краснухи и оспы, Эпштейна–Барр.

Для диагностики инфекции, вызванной C. pneumoniae, обычно используется метод микроиммунофлюоресценции. Результат считается положительным при четырехкратном увеличении титра АТ в парных сыворотках или при однократном определении титра IgM ≥1:16 или IgG ≥1:512 [61]. Аналогичные критерии применяются для C. psittaci. Чувствительность микроиммунофлюоресценции составляет 39–100%, специфичность — 94–100%, что превышает эти показатели в РСК и ИФА, применение которых при серодиагностике инфекций НДП хламидийной этиологии считается нецелесообразным [62]. При неонатальной пневмонии, вызванной C. trachomatis, титр видоспецифических IgM АТ 1:32 диагностический и коррелирует с результатами культуральной диагностики. В то же время определение IgG малоинформативно из-за циркуляции у детей до 12 мес материнских АТ.

Ввиду низкой чувствительности культурального метода серологические тесты составляют основу диагностики микоплазменной инфекции. Холодовые агглютинины, выявляемые в реакции агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами 0(I) группы крови при 4 °С, присутствуют приблизительно у 50% больных пневмонией, обусловленной M. pneumoniae. Их уровень приходит в норму через 6 нед после острой инфекции. Однако холодовые агглютинины могут образовываться при целом ряде вирусных инфекций, лимфомах, аутоиммунных нарушениях, что снижает их диагностическую ценность. Комплементсвязывающие АТ выявляют в РСК у 85% пациентов, что согласуется с результатами культурального метода. При этом важны четырехкратное нарастание титров АТ либо титр ≥1:80 при однократном исследовании сыворотки. В последние годы получил развитие метод ИФА для выявления специфических микоплазменных IgM АТ и IgА АТ; его чувствительность и специфичность выше, чем РСК [62]. IgM АТ обнаруживают на 1-й неделе заболевания и достигают пика на 3-й неделе, у взрослых они

продуцируются нерегулярно, поэтому отрицательный результат не исключает наличие инфекции. IgА АТ более постоянны, их продукция не зависит от возраста пациентов.

Серодиагностика грибковых инфекций не всегда информативна. Определение АТ к C. albicans не позволяет провести дифференциальную диагностику локализованного и диссеминированного кандидоза, так как эти АТ присутствуют и у больных, и у здоровых пациентов и только в 50–75% наблюдений встречаются при диссеминированном кандидозе [40].

РСК для выявления АТ к B. dermatidis характеризуется низкой чувствительностью и специфичностью (25%), титр АТ может повышаться при инфекциях, вызванных C. immitis и H. istoplasma capsulatum. Иммунодиффузионный тест для выявления АТ к B. dermatitidis более чувствительный

испецифичный (40–70%), чем РСК. Однако и отрицательный результат не исключает диагноз «бластомикоз».

При серодиагностике криптококкоза используют реакцию преципитации для определения IgM АТ, которые обнаруживают на 2–3-й неделе заболевания у 75% больных, затем постепенно исчезают [52]. Комплементсвязывающие IgG АТ появляются позднее, их титр 1:32 и выше предполагает возможность диссеминированной инфекции.

При легочном гистоплазмозе у 90% больных определяются АТ к H. capsulatum в РСК и методом иммунодиффузии, при диссеминированном процессе они встречаются в 80% наблюдений [63]. Перекрестные реакции наблюдаются при бластомикозах, коккцидиоидомикозе и паракоккцидиоидомикозе.

Молекулярно-генетические методы. Основу мо- лекулярно-генетических методов составляют ПЦР

иее модификации. Принцип ПЦР заключается в многократном повторении (амплификации) исследуемых локусов нуклеиновых кислот термостабильной полимеразой для наработки достаточного количества ДНК и обнаружения ее методами электрофореза и гибридизации. Этот процесс достигается с помощью введения в реакционную смесь коротких молекул ДНК (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям того микроорганизма, который необходимо обнаружить. Связывание праймеров с соответствующими участками ДНК/РНК приводит к образованию локальной двухцепочечной структуры узнаваемой полимеразой, которая начинает достраивать ее в направлении 5-3’, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, присутствующие в реакционной смеси. Таким образом, если один из праймеров связывается с прямой цепью, а другой — с обратной, происходит наработка продукта, ограниченного с двух сторон этими праймерами. Поскольку каждый из вновь образованных продуктов — матрица для дальнейшей амплификации, происходит экспоненциальное увеличение их количества.

Анализ полученных продуктов амплификации с помощью электрофореза заключается в разделении ампликонов под действием электрического поля в агарозном или полиакриламидном геле. После окончания электрофореза оцениваются наличие и размер полученных продуктов реакции амплификации. Гибридизация заключается в нанесении на твердую фазу (микропланшет) олигонуклеотидных зондов, комплементарных внутренней структуре исследуемых ампликонов (прямая гибридизация), или нанесении на твердую фазу полученных ампликонов (обратная гибридизация).

Добавление ампликонов или зондов, меченных либо с помощью радиоактивных меток, либо флюоресцентных, либо конъюгированных с ферментом, способным осуществлять цветовую реакцию (например, пероксидаза хрена), приводит к образованию комплексов, которые можно определять с помощью соответствующих методов. Достоинство гибридизации по сравнению с гельэлектрофорезом — увеличение специфичности метода и объективизация оценки результатов эксперимента в автоматическом режиме. К недостаткам относятся трудоемкость, необходимость использования специальной аппаратуры и более высокая стоимость.

Существуют наборы ПЦР для выявления отдельных микроорганизмов (L. pneumophila,

C. pneumoniae, M. pneumoniae, S. pneumoniae, M. tuberculosis, M. avium, M. kansasii, H. capsulatum, B. dermatidis, C. immitis, A. fumigatus, P. jiroveci,

T. gondii, респираторных вирусов, вирусов простого герпеса, ЦМВ, ТОРС-коронавируса) и одновременного выявления нескольких возбудителей.

Наиболее перспективна мультиплексная ПЦР в реальном времени, позволяющая определять наличие ДНК различных возбудителей в одной пробирке в течение менее 3 ч. Принцип основан на непосредственном иммунофлюоресцентном определении амплифицированных генов по мере их генерации in vitro. Эффективность подобного подхода была доказана в ряде исследований [64]. Однако требуется осторожность в интерпретации результатов для дифференциации между колонизацией (или латентными формами) и инфекцией. Пневмококки, хламидии, микоплазмы, кандиды, пневмоцисты встречаются у индивидуумов и при отсутствии инфекции. Герпесвирусы, токсоплазмы, пневмоцисты могут существовать в латентной стадии в тканях и не вызывать инфекцию. В настоящее время среди молекулярно-биологических методов для точной идентификации в сложных случаях, для изучения эпидемиологической значимости штаммов микроорганизмов используют методы мультилокусного секвенирования и полного геномного секвенирования [65]. Некоторые организмы трудно или невозможно выявить другими методами, и молекулярная диагностика становится единственно возможной. Диагностическая специфичность и чувствительность могут достигать 98–100%. К таким методам относится мультило-

кусное секвенирование, секвенирование 16SrRNA, полное секвенирование генома.

Заключение

Лаборатории клинической микробиологии играют жизненно важную роль в этиологической диагностике инфекций нижних дыхательных путей. Надежность результатов микробиологического исследования зависит от целого ряда условий: правильного получения адекватного материала; своевременной его доставки в лабораторию в соответствующих средах или контейнерах; предварительной обработки образцов в соответствии с задачами исследования; чувствительности и специфичности используемых методов для выявления возбудителя и его маркеров; грамотной трактовки результатов исследования в соответствии с клиническими, радиографическими и другими лабораторными данными пациента. Комплекс современных адекватных методов позволяет в настоящее время правильно и быстро идентифицировать возбудителей респираторных инфекций, осуществлять мониторинг хронической инфекции легких, выявлять источник инфекции и назначать необходимую терапию, а также осуществлять профилактические мероприятия.

Список литературы

См.

5.3. Методы визуализации

И.Е. Тюрин

Введение

Методы лучевой диагностики (син.: методы визуализации, методы диагностической радиологии) играют ключевую роль в выявлении, определении характера и распространенности патологического процесса органов дыхания, а также в оценке эффективности проводимого лечения.

В течение последних 20 лет в торакальной радиологии произошли кардинальные изменения. В начале 1970-х годов появились первые образцы рентгеновских компьютерных томографов, и уже в середине десятилетия стало возможным аксиальное сканирование различных анатомических областей тела, в том числе и органов грудной полости на задержанном дыхании. В 1980-х годах разработана методика высокоразрешающей КТ для изучения патологии легких, началось клиническое применение магнитно-резонансной томографии (МРТ) и УЗ-методов исследования, которые получили широкое распространение в последнем десятилетии прошлого века, в том числе и при исследовании органов дыхания. В этот же период времени произошло становление спиральной технологии сканирования в КТ. На ее основе

возникли первые клинические образцы программ для трехмерных преобразований и методики компьютерно-томографической ангиографии. Начало нового века характеризуется созданием КТ-аппаратов с многорядными детекторами и интенсивным внедрением в клиническую практику ПЭТ как в виде самостоятельного исследования, так и в сочетании с КТ.

На фоне революционных преобразований в области современных томографических технологий продолжается интенсивное развитие традиционного рентгеновского исследования. От рутинных рентгенотомографических методик эта область торакальной радиологии перешла к цифровой радиологии, основу которой составляют современные цифровые детекторы рентгеновского излучения.

В результате произошедших технологических изменений традиционное рентгенорадиологическое исследование больных с заболеваниями органов дыхания переросло торакальную радиологию, использующую все современные методы лучевой диагностики:

•Традиционное рентгенологическое исследование.

•Рентгеновская компьютерная томография (КТ).

•МРТ.

•Ультразвуковое исследование (УЗИ).

•Радионуклидные исследования.

•ПЭТ, в том числе в сочетании с КТ (ПЭТ/КТ).

•Интервенционные диагностические и лечебные процедуры под лучевым наведением (рентгеноскопия, УЗИ, КТ).

Традиционное рентгеновское исследование

Открытие в 1896 г. рентгеновского излучения В.К. Рентгеном и явления радиоактивности А. Беккерелем стало отправной точкой многолетнего пути развития торакальной радиологии, накопления знаний и клинического опыта, освоения новых областей медицинской практики.

Уже в 1897 г. была выполнена первая рентгенограмма органов грудной полости. В начале прошлого века (1903 г.) рентгеновские снимки начали выполнять на пластинах, покрытых бромидом серебра (C. Schleussner), в 1913 г. появилась отсеивающая решетка для фильтрации вторичного излучения при рентгенографии (G. Bucky). Важной вехой на пути становления торакальной радиологии стала разработка в 1920-х годах теории и практики линейной томографии (A.- E.-M. Bocage, E. Pohl).

В конце этого же десятилетия были проведены первые бронхографические исследования (Sicard, Forestier). В 1928 г. выполнены первые ангиографические исследования периферических сосудов (R. Dos Santos, A. Lamas, P. Caldas), а в 1929 г. проведена первая ангиопульмонография (АПГ) (W. Forssmann). За этим последовали первый проявочный автомат для обработки рентгеновской

пленки в 1942 г. (Malincrodt) и первая система для компьютерной (беспленочной) рентгенографии (Fuji), усилители рентгеновского изучения для проведения рентгеноскопии с использованием телевизионного монитора (J.W. Coltman). В начале 1990-х годов были представлены первые образцы цифровых рентгеновских аппаратов, которые в настоящее время представляют один из наиболее интенсивно развивающихся сегментов всей радиологической техники.

Исторически все методики традиционного рентгеновского исследования разделяют на основные и специальные. Под этим подразумевается, что рентгеновское исследование органов грудной полости при любом виде патологии должно начинаться с одной из основных методик и, в случае необходимости, продолжаться с использованием набора специальных методик. К основным методикам традиционно относят обзорные изображения анатомической области, такие как рентгенография, рентгеноскопия или флюорография. Среди специальных методик принято выделять томографические исследования (линейная томография, зонография), методики контрастирования и рентгенофункциональные исследования. Во второй половине прошлого века эти методики были основным инструментом обследования больных с патологией органов дыхания, в том числе раком легкого.

Свнедрением в клиническую практику КТ,

атакже МРТ, УЗИ и эхокардиографии (ЭхоКГ) большинство из них перестали использовать или объем таких исследований значительно уменьшился. Так, практически все методики контрастирования (бронхов, сосудов, плевральной и брюшной полости, средостения и перикарда) представляют в настоящее время лишь исторический интерес. Вся необходимая информация об этих анатомических структурах может быть получена с помощью современных томографических технологий. Исключением являются ангиографические исследования сосудов грудной полости в тех случаях, когда они являются составной частью интервенционных радиологических процедур. Многократно сократилось количество линейных томографий, которые выполняются в тех лечебных учреждениях, где проведение КТ больным с легочной патологией не представляется возможным. Резко сократились показания к рентгеноскопии, она перешла из разряда основных методик рентгеновского исследования легочных больных в категорию специальных методик, проводимых по специальным и относительно узким показаниям. Обычно это контроль состояния грудной полости после торакальных операций, выявление жидкости в плевральной полости или проведение инвазивных процедур под контролем рентгеноскопии.

Пленочная рентгенография

Рентгенография является наиболее частой рентгенологической процедурой вообще и орга-

нов грудной полости в частности. Исследование может представлять собой обзорный снимок всей анатомической области в одной из стандартных проекций или снимок части грудной полости. В первом случае речь идет об обзорной рентгенографии, во втором — о прицельных и парциальных рентгеновских снимках.

Показанием к проведению рентгенографии является любое подозрение на патологический процесс в легких, средостении, плевральной полости или грудной стенке, а также оценка выявленных изменений в динамике.

Специальной подготовки к проведению рентгенографии органов грудной полости не требуется. Обзорные рентгенограммы выполняют при вертикальном положении пациента в двух проекциях — прямой передней и одной из боковых, правой или левой. При рентгенографии в прямой передней проекции пациента устанавливают лицом к вертикальной стойке и плотно прислоняют грудью к воспринимающему устройству. Это может быть кассета с рентгеновской пленкой, цифровая камера или другое приспособление. Плечи пациента опущены, подбородок приподнят. Для отведения лопаток кисти рук прижимают к бедрам, а локти направляют вперед (рис. 5.12).

Оптимальным размером рентгеновской пленки для рентгенографии является 35×35 см. Кассету устанавливают таким образом, чтобы верхний ее край находился на уровне VII шейного позвонка. Центральный пучок направляют в центр кассеты по срединной линии тела пациента через область VI грудного позвонка (уровень нижнего угла лопатки). Экспонирование производят после обычного (не форсированного) вдоха на задержанном дыхании.

О точности установки пациента в прямой проекции свидетельствует одинаковое расстояние от линии остистых отростков до правого и левого грудино-ключичного сочленения. На рентгеновском снимке должны отображаться все анатомические структуры груди, включая оба легочных поля, реберно-диафрагмальные синусы и поддиафрагмальная область, верхушки легких и мягкие ткани грудной стенки.

Кроме стандартного снимка в прямой передней проекции, аналогичные изображения можно получить при исследовании в прямой задней проекции и в положении лежа на боку при горизонтальном ходе рентгеновских лучей (латерография). Эти снимки чаще выполняют вне рентгеновского кабинета, в условиях реанимации или приемного покоя (рис. 5.13).

Рентгенография в боковой проекции также проводится в вертикальном положении. Пациент прижимается к воспринимающему устройству соответствующим боком, руки его подняты кверху и скрещены на голове. Оптимальный размер рентгеновской пленки 30×40 см. Верхний край кассеты на уровне VI шейного позвонка, центральный пучок направляют на среднюю подмышечную линию, на ширину кисти ниже подмышечной ямки.

Помимо рентгенографии в стандартных, прямой и боковой, проекциях, обзорные снимки могут быть получены и в атипичных проекциях. Обычно это правая или левая косые проекции, когда пациент разворачивается соответствующим боком к кассете под углом 45°. В прошлом такие рентгенограммы имели большое значение для оценки состояния камер сердца. В настоящее время они практически не используются.

Прицельные рентгенограммы выполняют для детализации изменений, выявленных при обзорной рентгенографии. Они могут выполняться у вертикальной стойки с использованием пленки меньшего формата (парциальные снимки) или во время рентгеноскопии, когда пациента ставят в оптимальное положение под визуальным контролем рентгенолога (рис. 5.14). Другим видом специальных рентгенографических исследований являются рентгенофункциональные пробы, проводимые на выдохе, при натуживании (проба

Вальсальвы) и других физиологических маневрах. Особым видом прицельных снимков являются рентгенограммы области верхушек легких в положении лордоза, часто используемые во фтизиатрической практике.

Рентгенографический контраст

Термин «рентгенографический контраст» определяет величину разницы почернения двух участков на рентгенограммах. Большая разница соответствует высокому контрасту, соответственно,

меньшая величина — меньшей контрастности. Высококонтрастным считается такое изображение, на котором объекты, интенсивно задерживающие рентгеновское излучение, выглядят белыми, и наоборот, участки, соответствующие частям тела, мало поглощающими рентгеновское излучения, — черными. Контраст определяется физическими свойствами объекта исследования, энергией рентгеновского излучения, используемым сочетанием «пленка–усиливающие экраны» и выраженностью вторичного рассеянного излучения.

При рентгенографии груди этот параметр имеет исключительно большое значение. Большинство рентгеновских снимков выполняется для оценки легких и средостения. Однако большая часть легочной ткани перекрывается плотными анатомическими структурами, такими как ребра, ключицы, позвонки, диафрагма и средостение. В случае выполнения высококонтрастного снимка те участки легких, на которые проецируется изображение этих анатомических структур, практически неразличимы. С другой стороны, изображение тени средостения, лишенное в силу чрезмерной контрастности своей обычной структуры, не пригодно для выявления многочисленных патологических процессов, расположенных позади сердечной тени, на фоне бифуркации трахеи, в области корней легких.

Основным фактором, влияющим на рентгенографический контраст выбранной анатомической области, является энергия рентгеновского пучка, которая, в свою очередь, определяется величиной напряжения генерирования рентгеновского излучения. Чем выше напряжение, тем больше проникающая способность излучения, тем меньше рентгенографический контраст. В этом случае снижение контраста наиболее плотных анатомических структур на фоне сохранения контраста легочной ткани приводит к повышению информативности изображения.

Рентгенография легких должна проводиться с использованием жесткого рентгеновского излучения, при напряжении генерирования свыше 100 кВ, обычно 120–150 кВ. Меньшие величины напряжения приводят к излишней контрастности изображения и ухудшению качества изображения.

Использование жесткого излучения имеет два важных следствия. Во-первых, снижение рентгенографического контраста снижает выявляемость обызвествлений и других высокоплотных включений. Поэтому для уточнения структуры патологических образований могут использоваться прицельные снимки, выполненные мягкими рентгеновскими лучами (двухэнергетическая рентгенография).

Во-вторых, жесткое рентгеновское излучение приводит к увеличению количества вторичного рассеянного излучения, которое индуцируется в тканях исследуемой области при прохождении квантов основного пучка излучения. Хаотично направленное рассеянное излучение попадает

на рентгеновскую пленку и снижает контраст. Поэтому при рентгенографии легких жесткими лучами применение отсеивающей решетки является обязательным условием.

Разрешение

Пространственное разрешение можно определить как способность выявлять мельчайшие детали изображения. При использовании стандартной комбинации экран–пленка этот показатель достигает 10–12 пар линий/мм. Тем не менее известно множество факторов, снижающих пространственное разрешение при рентгенографии легких. Наиболее важными из них являются нечеткие, размытые контуры деталей изображения, что определяется в рентгенологии термином «нерезкость».

Динамическая нерезкость возникает вследствие движения объекта исследования в момент экспозиции. При рентгенографии легких основным источником динамической нерезкости являются движения сердца и крупных сосудов, а также непроизвольные движения пациента в момент включения высокого напряжения. Геометрическая нерезкость возникает при использовании слишком большого фокусного пятна анода рентгеновской трубки в результате чрезмерного уменьшения фокусного расстояния (фокус рентгеновской трубки — экран) или слишком большого расстояния между объектом и рентгеновской пленкой. Экранная нерезкость является результатом гранулярного строения поверхности экрана.

Из всех видов нерезкости наибольшее практическое значение при рентгенографии легких имеет максимально полное исключение динамической нерезкости за счет сокращения выдержки до 0,04 с и менее. Уменьшение геометрической нерезкости возможно за счет адекватного фокусного расстояния величиной 180–200 см.

Сигнал/шум

Все системы получения изображений страдают от так называемого шума. Чем больше различия в полезном изображении и возникающих при регистрации излучения помехах, тем выше информативность. Квантовый шум зависит прежде всего от количества квантов рентгеновского излучения, попадающего на воспринимающее устройство — систему экран–пленка. Повышение чувствительности экранов или рентгеновской пленки либо того и другого вместе позволяет уменьшить количество излучения (количество квантов в единицу времени), необходимого для получения изображения. Поэтому использование таких систем, направленное на уменьшение экспозиции, обычно приводит также и к увеличению квантового шума и зернистости изображения.

Технологические стандарты

Для обеспечения высокого качества рентгеновских снимков легких и воспроизводимости