2 курс / Гистология / Цитология,_гистология_и_эмбриология_Часть_1_Вишневская_Т_Я_

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Л.Л. Абрамова Т.Я. Вишневская М.Т. Куспакова

ЦИТОЛОГИЯ,

ГИСТОЛОГИЯ И ЭМБРИОЛОГИЯ

Часть 1

Допущено Учебно-методическим объединением высших учебных заведений Российской Федерации по образованию в области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебно-методического пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся

по направлению подготовки (специальности) 111801 «Ветеринария» (квалификация (степень) «специалист»)

2014

ВВЕДЕНИЕ

«Цитология, гистологияиэмбриология» являетсядисциплинойбазового уровня обучения и представлена в структуре основной образовательной программы в цикле «Общепрофессиональные ветеринарно-биологические дисциплины».

Основная цель дисциплины «Цитология, гистология и эмбриология» при подготовке ветеринарных врачей состоит в том, чтобы дать студентам основополагающие морфологические знания на клеточном и субклеточном уровняхофункционирующем, развивающемсяиприспосабливающемсяорганизмеизакономерностяхегоразвитиявонтогенезе. Учебно-методическое пособие может помочь студентам в самостоятельном изучении микроскопических препаратов при прохождении практического курса предмета. Оно требует обязательного предварительного знакомства с теоретическим материалом занятия, позволяющим судить о строении, функциональном значении и методах выявления изучаемых структур, дает студентам возможность познакомиться с основами техники приготовления гистологических препаратов, помогает выработать навыки работы с микроскопом. Контрольные вопросы в конце каждого раздела рекомендуются студентам при самоподготовке. Изучение общей части дисциплины «Цитология, гистология и эмбриология» предполагается в течение 3 семестра.

Обучение по дисциплине помогает студенту:

–овладеть культурой мышления, способностью к обобщению, анализу, восприятию информации, постановке цели и выбору путей ее достижения

(ОК-1);

–уметь логически верно, аргументировано и ясно строить устную и письменную речь (ОК-2);

–осознать социальную значимость своей будущей профессии, обладает высокой мотивацией к выполнению профессиональной деятельности

(ОК-4);

–приобрести способность и готовность анализировать закономерности функционирования органов и систем организма, использовать знания морфофизиологических основ, основные методики клиникоиммунологического исследования и оценки функционального состояния организма животного для своевременной диагностики заболеваний (ПК-5).

3

1 МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основным рабочим инструментом на лабораторно-практических занятиях по гистологии является световой микроскоп. Исследование с помощью микроскопа производится преимущественно в проходящем свете, поэтому исследуемый объект должен быть тонким (не более 10 мкм) и прозрачным.

Тканииорганыдлягистологическогоисследованиявбольшинствеслучаев подвергаются сложной обработке. Основными этапами такой подготовки материала являются:

–взятие материала (витальная биопсия или поствитально);

–фиксация;

–обезвоживание и уплотнение;

–заливка в плотную среду;

–изготовление срезов;

–окрашивание, обезвоживание, просветление и заключение срезов

всреду, обеспечивающую долговременное сохранение препарата.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА. Необходимым условием взятия материала (тканей и органов) является «свежесть» материала. В органах после смерти животного или в образце органа, взятом прижизненно, происходят необратимые диссимилятивные процессы, в результате чего изменяются структуры клеток и тканей, что не соответствует их строению в норме. Поэтому материал для гистологического исследования берется сразу после иссечения или убоя животного. Из органа удаляется кусочек размером до 1 см3. И поскольку в его тканях и клетках совершаются процессы разрушения, необходимо исследуемый материал зафиксировать (законсервировать) в таком состоянии, в каком материал был взят из организма.

ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА. Этот процесс заключается в действии на материал фиксирующих жидкостей и сопровождается быстрым свертыванием белков (коагуляцией). При этом отношение между структурами ткани сохраняется. В качестве фиксаторов используют либо одно вещество (простые фиксаторы), либо несколько компонентов (сложные фиксаторы). Такими веществами являются формалин, спирт, уксусная кислота, сулема и др. Наиболее распространенным и в какой-то степени универсальным является 10 – 15%-ныйводный раствор нейтрального формалина.

Фиксатор подбирается в зависимости от целей исследования. Так для изучения содержания гликогена (животный крахмал) наилучшим фикса-

4

тором является (абсолютный или 100о) спирт, а для сохранения в клетках жира нужно применять формалин и т.д.

Если фиксатор содержит вещества, мешающие дальнейшей обработке, например, сулему, двухромовокислый калий, кислоты, то после фиксации кусочки промывают в проточной воде.

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И УПЛОТНЕНИЕ МАТЕРИАЛА. С этой целью обезвоживание материала производится в спиртах с возрастающей концентрацией (50о, 70о, 90о, 100о), здесь же осуществляется и частичное обезжиривание. Затем материал выдерживают в смеси 100о спирта и эфира, где осуществляется окончательное обезвоживание и интенсивное обезжиривание. Однако в результате такой обработки материал оказывается недостаточно плотен, а главное, недостаточно однороден, поэтому его необходимо залить в специальную плотную среду.

ЗАЛИВКА МАТЕРИАЛА. В качестве плотных сред используются целлоидин, парафин, желатин, смолы и др. Материал проводится постепенно черезрядсредотжидкойдоплотной. Кусочек, темсамым, равномернопропитывается и становится однородным и плотным.

Принципзаливкизаключаетсявпоследовательномпроведениикусочка через ряд жидкостей, каждая предыдущая из которых должна обладать способностью смешиваться с последующей. Схема заливки в парафин: 1) 100о спирт; 2) смесь 100о спирта и ксилола (либо хлороформа) 1:1; 3) ксилол (хлороформ); 4) раствор парафина в ксилоле (хлороформе) в термостате при t=37о С; 5) расплавленный парафин.

Время заливки определяется величиной объекта. После пребывания

врасплавленном парафине (в термостате при t=54о С) кусочек полностью им пропитывается. После этого кусочек в формочке заливается расплавленным парафином, осторожно погружается в проточную воду и застывает

вплотный блок.

ИЗГОТОВЛЕНИЕ СРЕЗОВ. На специальных аппаратах – микротомах производится приготовление очень тонких срезов толщиной 5 – 10 мкм. В последующем срезы освобождают от пропитывающих плотных сред. Возникает дальнейшая необходимость препараты контрастировать, т.е. окрасить различные компоненты тканей и клеток в яркие контрастные цвета для детального изучения.

При необходимости получения препарата в короткий срок (с диагностической целью) используют замораживающий микротом, который позволяет изготовить срезы из кусочка, только что зафиксированного жидким азотом (t = -180о С), углекислотой и др. Недостатком этого метода является

5

то, что срезы получаются более толстыми, чем из парафиновых (или целлоидиновых) блоков (более 10 мкм).

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ. Основной принцип окраски заключается

визбирательном окрашивании кислыми и основными красителями различных тканевых структур. Наиболее распространенным основным красителем является гематоксилин. Структуры, имеющие кислую реакцию обладают сродством с основным красителем, окрашиваются гематоксилином

всиний или фиолетовый цвет, поэтому эти структуры называют базофильными (ядра клеток).

Наиболее распространенным кислым красителем является эозин. Структуры, имеющие щелочную реакцию, обладают сродством с кислыми красителями, окрашиваются эозином в розовый цвет, и их называют ацидофильными (цитоплазма клеток, волокна межклеточного вещества). В результате окраски срезов основными и кислыми красителями получается контрастный препарат с отчетливыми структурами.

Окраска срезов гематоксилином и эозином:

–окрашивание гематоксилином – 3 мин.

–промывка в водопроводной воде – 5 мин.

–окрашивание эозином – 1 мин.

–промывка в дистиллированной воде – 2 мин.

–обезвоживание в 96о спирте – 2 мин.

–обезвоживавание в 100о спирте – 2 мин.

–просветление в ксилоле-1 – 2 мин.

–просветление в ксилоле-2 – 2 мин.

–заключение срезов в бальзам.

Чтобы приготовить постоянный гистологический препарат с большим сроком хранения, окрашенные в водной среде срезы обезвоживают в спиртах возрастающей крепости (96ои 100о), просветляют в ксилоле. Затем срезы помешают на предметные стекла, наносят каплю бальзама (раствор кедровой или пихтовой смолы в ксилоле) и накрывают покровным стеклом. Срезы оказываются заключенными в прозрачную среду.

Изготовленные гистологические препараты изучают в световом микроскопе, зарисовывают и подписывают учебные элементы:

–ядро (базофильная окраска);

–цитоплазма (ацидофильная, оксифильная, эозинофильная окраска).

МЕТОДЫ БИОМЕТРИИ (морфометрии). Включают подсчет клеток, объем ядер, цитоплазмы, их ядерно-цитоплазматическое отношение, количество митотически делящихся клеток в процентах, как показатель степени регенерации.

6

МЕТОД ЦИТОФОТОМЕТРИИ позволяет с помощью специального прибора (спектрометра) дать количественную оценку вещества, фермента и т.д., входящего в состав клетки.

МЕТОД ФАЗОВОГО КОНТРАСТА дает изображения объектов, невидимых при обычных методах микроскопии. Он основан на различном преломлении света в зависимости от плотности структур. Требует использования специальных микроскопов или приставок к ним.

МЕТОД РАДИОАВТОГРАФИИ применяется для изучения синтетическихпроцессоввклетке, поступленияивыведениявеществ, распределения их в клетке и т.д. Сущность метода состоит в том, что в организм вводится вещество, содержащее радиоактивные (меченые) Р, Н, С и др., которые включаются в ткани клетки. Место нахождения введенного вещества определяется на гистологическом препарате по излучению, которое улавливается чувствительной эмульсией, нанесенной на препарат. Фотография этих следов (треков) излучения позволяет судить о распределении введенного радиоактивного элемента в клетках и тканях.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. Метод позволяет получить увеличение объектов в десятки и сотни тысяч раз. Объект просматривается в потоке электронов, концентрация которых и направления на объект регулируются магнитными устройствами. Изображение изучаемого объекта видно на специальном экране микроскопа и фотографируется на фотопластинку.

Как и в случае световой микроскопии, исследуемый материал подвергается фиксации, обезвоживанию и заливке в плотные среды. Для фиксации берется свежий материал, размеры кусочков не должны превышать 1 мм3. Обычно для фиксации используется глютаровый альдгидочетырехокись осмия, марганцовокислый калий. Обезвоживание производят быстро в спиртах (ацетонах) возрастающей крепости.

Для заливки используют эпоксидные смолы (аралдит и энон). Изготовление ультратонких срезов (40 – 50 нм) производят на ультратоме. Затем срезы помешают на металлическую сеточку, контрастируют и рассматривают в потоке электронов.

МЕТОД ПРИЖИЗНЕННОГО НАБЛЮДЕНИЯ. Маленький кусочек ткани помещается на предметное стекло в физиологический раствор (для млекопитающих 0,9%-ный раствор NаСl), покрывается покровным стеклом и исследуется в световой микроскоп.

Метод позволяет исследовать и фотографировать поведение живой клетки в течение недолгого времени.

7

2 ЦИТОЛОГИЯ

Практическиецелидлялабораторно-практическихзанятийпоцитологии:

1)уметь пользоваться микроскопом для исследования;

2)уметь различать клетки и неклеточные структуры в срезах органов;

3)уметь идентифицировать в клетках ядро, цитоплазму и плазмолемму на микроскопическом уровне;

4)уметь дать функциональную характеристику периодам жизненного цикла клетки, идентифицировать стадии митоза;

5)уметь определять половые клетки и детали их строения на микроскопическом уровне.

2.1 Форма клеток, неклеточные структуры

СХЕМА. Различные формы клеток.

9

ПРЕПАРАТ№ 46. СИМПЛАСТ(поперечно-полосатаямышечнаяткань языка кролика)

1. Ядра

2. Сарколемма

3. Саркоплазма

4. Поперечнаяисчерченность

ПРЕПАРАТ №19. СИНЦИТИЙ (ретикулярная ткань лимфатического узла овцы)

1. Ядра

2. Цитоплазма

3. Отростки клеток

2.2 Органоиды и включения

ПРЕПАРАТ № 6. МИТОХОНДРИИ (хондриом) Окраска: по Альтману.

При малом увеличении нужно найти покровную ткань кишки с вертикально разрезанными клетками, основания которых располагаются на ярко-розовой базальной мембране, а верхушки покрыты толстым слоем – кутикулой.

При большом увеличении рассмотрите митохондрии, имеющие вид ярко-красных зернышек и палочек, располагающиеся в верхней надъядерной части клеток.

Препарат рассмотреть и зарисовать.

1. Ядро клетки

2. Скопления митохондрий

3. Цитоплазма

10