2 курс / Гистология / Гистология_История_науки_Методы_исследования_Гистологическая_техника

Трагическая личность – профессор Горянинов из Петербургской военномедицинской академии – за 5 лет до Шлейдена и Шванна изложил положения клеточной теории (1834 год).

21

В России 1-я кафедра гистологии, эмбриологии и сравнительной анатомии на медицинском («лекарском») факультете появилась в Московском Университете по новому (3- му, 1863 года) уставу Российских университетов в 1864 году (до этого элементы гистологии преподавались на кафедре анатомии – ординарным профессорoм Соколовым Иваном Михайловичем …

22

11

Последователем Павла Эйнбродта стал А.И.Бабухин - основатель московской школы гистологов (описал гистофизиологию мышечной и нервной ткани: развитиенервных волокон, строение сетчатки), зав. 1-ой кафедрой гистологии в России, созданной в Московском университете в 1864 г.

Позднеев этом же годусоздана кафедра гистологии в Казанском университете.

12

В 1864 году кафедра гистологии оставалась в Московском университете

К.Э.Бэр (1792-1826) –

эмбриолог, зав. каф. сравнительной анатомии и физиологии

– первымв Россиив 1841 годуначал читать курс гистологиив Петербургской медикохирургической академии, который с 1852 г. выделен в отдельный курс. Кафедра гистологии основанав 1868 г. (Н.М.Якубович – 1-ый

зав.каф.).

26

13

Кафедрагистологии Медикохирургической академии (первая в Петербурге) создана в 1868 г. Н.М.Якубовичем (описал тонкое строениеЦНС, открыл ядра спинного мозга).

С 1895 г. кафедрой заведовалМ.Д. Лавдовский (1846-1902), описавший регенерацию нервных волокон, автор 1-го вРоссии (с Ф.В.Овсянниковым) учебникапогистологии.

28

14

Ф.В.Овсянников (1827-1906)

– в 1858-1862 г. возглавлял кафедру физиологии и общей патологии на мед. факультете Казанского университета. Он основоположник экспериментальной физиологии и микроскопической анатомии в России (его ученик – И.П.Павлов).

В Петербургеон начинал преподавать гистологию на кафедре анатомии и физиологии Петербургского университета, ас 1894 г. – на вновь созданной кафедре гистологии. Одиниз основателей морфофункционального направления (гистофизиология органов чувств).

29

РАЗВИТИЕ И СТАНОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИИ КАК НАУКИ (МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ ПЕРИОД)

15

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.

Методы изучения живых тканей (культивирование in vitro – тканеваяинженерия).

Методы изучения фиксированных тканей (светооптические и электронно-микроскопические).

Светооптические: темнопольная, поляризационная, фазовоконтрастная, интерференционная (поляризационная+фазовоконтрастная), люминисцентная, ультрафиолетовая.

Гистохимия – устанавливает локализацию химических веществ в структурах тканей (кислая фосфатаза – лизосомы, ацетилхолинэстераза – нервная ткань – для диагностики болезни Гиршпрунга.

Иммуногистохимия – более чувствительный и специфичный метод гистохимии, где любой антиген может быть выявлен с

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.

Методы изучения живых тканей (культивирование in vitro – тканевая инженерия, изучение поведения внутриклеточных паразитов: вирусов, микоплазм).

Методы изучения фиксированных тканей (светооптические и электронно-микроскопические).

Светооптическиеметоды микроскопического исследования: - Обычнаясветоваямикроскопия (окрашенныхгистологическими красителями объектов)

- темнопольная микроскопия (для живых неокрашенных объектов – микроорганизмов), микроскоп имеет специальный конденсор, делающий объект освещеннымна темномфоне.

- фазово-контрастная микроскопия использует оптическую систему, которая позволяет рассмотреть прозрачные объекты без окраски (например, живые объекты). Она основана на принципе, что луч, проходя через клетки и межклеточное вещество, имеющие разный показатель преломления, меняет свою скорость по-разному (т.е. меняется фаза световой волны). Структуры выглядятболее темнымиили более светлыми.

интерференционная (поляризационная + фазово-контрастная) микроскопия создает 3-х-мерное изображение (используется

32

оптика Номарского).

16

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.

Поляризационная микроскопия позволяет увидеть объекты, состоящие из высоко организованных молекул и, как следствие, обладающие двойным лучепреломлением: как коллаген, микрофиламенты и проч. В нем устанавливают два перпендикулярных фильтра, между которыми помещается объект. Если в объекте есть структуры с двойным лучепреломлением, то их ориентированные молекулы развернут ось света, исходящего от поляризатора, и будут выглядеть яркими натемномфоне.

Люминисцентная микроскопия. Люминисценция – это способность некоторых веществ, будучи облученными одной длиной волны, испускать излучение большей длины волны. Обычно при облучении УФ-лучами объекты испускают волны световой длины. Естественная (первичная) люминисценция – слабая. Вторичная (наведенная) – сильная (например, при обработке парами формалина адреналин флюоресцирует. Можно усилить флюоресценцию флюоресцирующими красителями (родамин). В микроскопе два параллельных фильтра (для

фильтрацииволн от источника и от объекта.

33

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.

Электронная микроскопия:

- трансмиссионная ЭМ, как и световая, показываетт объект «на просвет». ЭМ использует вместо светового луча поток электронов, испускаемых раскаленным катодом, которые частично проникают через объект (ультратонкий срез ткани), частично задерживаются им. Вместо линз у ЭМ – электромагнитные катушки. Изображение получается не на сетчатке, а на фотопластинке (прошедшие через объект электроны засвечивают ее) или на флюоресцирующем экране. Электронная микроскопия дает черно-белое изображение! (Черные структуры – электроноплотные, белые – электронопрозрачные).

- сканнирующая ЭМ дает 3-х-мерное изображение (на поверхность объекта напыляется металл, от которого под углом отскакивают электроны).

Электронный микроскоп дает большее увеличение, чем световой микроскоп (свыше 100 тысяч раз) и большую разрешающую способность (0.2 мкм – 3 нм), так как длина волны у пучка

17

МИТОЗ. АНАФАЗА. Трансмиссионная электронная микроскопия. x

10,000.

Деление клетки в культуре. Сканнирующая электронная микроскопия, х5.000

18

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СМ и ЭМ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ 1.2

Гистохимия – это метод окраски тканей, выявляющий наличие и локализацию в клетках или межклеточном матриксе определенных макромолекул (биохимия выявляет лишь наличие и количество веществ, но не локализацию). При окраске срезов образуется цветной продукт, который выявляется световым микроскопом. Например, нуклеиновые кислоты можно выявить реакцией Фельгена (окраска галлоцианином-хромовыми квасцами, ДНК и РНК окрашиваются в темно-красный цвет), липиды – суданом III (желтый цвет) или серебрением (осмированием) – черный цвет.

Если до окраски по Фельгену обработать срез ферментом ДНКаза, расщепляющим ДНК, то после окраски окрашенными будут лишь РНК. Если обработать срез РНК-азой, то окраска будет обусловлена присутствием только ДНК. Такая предварительная обработка дает контроль гистохимических реакций.

38

19

1.2

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ

Разновидность гистохимии – гистоэнзимология – устанавливает локализацию ферментов (энзимов) в структурах тканей (кислая фосфатаза «метит» лизосомы, ацетилхолинэстераза – нервную ткань – (используется для диагностики болезни Гиршпрунга.

Количественная гистохимия с помощью фотометрии, денситометрии позволяет оценить количественно наличие веществ в структурах.

39

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ. 1.2

Иммуногистохимия – более чувствительный и специфичный метод, чем рутинная гистохимия, где любая макромолекула (антиген )может быть выявлена с помощью антител.

Например, лимфоциты Т-хелперы имеют на поверхности антигенный маркер CD4+. Если обработать срез антиCD4+антителами, связанными с флюоресцирующим красителем (флюоресцином, например), то по свечению в люминисцентном микроскопе можно выявить все Т-хелперы, присутствующие на срезе.

Описанный метод – это прямой иммуногистохимический метод. При непрямом методе флюоресцирующей меткой метят не первичное антитело, а вторичное антитело, которое является антителом к комплексу антиген-первичное антитело. Непрямой метод является более чувствительным.

Иммуногистохимия (так же как и рутинная гистохимия) применима как на уровне светового, так и электронного

20