2 курс / Гистология / ГИСТОЛОГИЯ_В_ЭЛЕКТРОННЫХ_МИКРОФОТОГРАФИЯХ

УДК 611.018(075.8)

ББК 28.706я73 П 640

Потапов, А.В.

П 640 Гистология в электронных микрофотографиях: учеб-

ное пособие / А.В. Потапов, С.В. Логвинов. – Томск: Изд-во СибГМУ, 2021. – 157 с.

Целью создания пособия является помощь студентам в освоении материала практических занятий при прохождении курса гистологии, цитологии и эмбриологии. Его основу составляют электронно-микро- скопические фотографии различных клеточно-тканевых элементов и их описания, отражающие основные разделы курса.

Пособие составлено в строгом соответствии с учебной программой по дисциплине и предназначено для студентов, обучающихся по специальностям «лечебное дело», «педиатрия», «стоматология».

УДК 611.018(075.8)

ББК 28.706я73

Рецензенты:

А.В. Герасимов – д-р мед. наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.

Л.Р. Мустафина – д-р мед. наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.

Утверждено и рекомендовано к печати учебно-методической комиссией лечебного факультета (протокол № 110 от 06.11.2020 г.) ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.

© А.В. Потапов, С.В. Логвинов, 2021 © Издательство СибГМУ, 2021

2

СОДЕРЖАНИЕ

ТЕМА 1

ПОНЯТИЕ ОБ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Электронная микроскопия является основным морфологическим методом, позволяющим изучать ультраструктуру различных тканей и органов на субклеточном уровне, а в некоторых случаях – переходить на молекулярный уровень исследования. Она также сохраняет возможности световой микроскопии (увеличения 300–1500), а использование «полутонких» срезов (0,5–1 мкм) позволяет соединить современные и классические методы исследований тканей и органов в норме и патологии. Используя электронную микроскопию в биологических и медицинских исследованиях, стало возможным изучить особенности строения клеточных мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и других органелл, входящих в состав клетки.

Электронный микроскоп – это прибор, в котором вместо лучей света используются пучки электронов, ускоренные до больших энергий (30–50 кэв) в условиях вакуума, что дает возможность получать сильно увеличенное изображение объектов.

Историческая справка

В начале ХХ века были получены все необходимые технические предпосылки для создания электронного микроскопа. В промышленных лабораториях, изучавших электронно-лучевые осциллографы, сконструировали вакуумную технику и стабильные источники высокого напряжения и тока, хорошие электронные эмиттеры. В 1924 г. Луи де Бройлем была выдвинута гипотеза о волновой природе электрона, которая была экспериментально подтверждена в 1927 г. К. Дэвиссоном и Л. Джермером в США и Дж. Томсоном в Англии, а Х. Буш обнаружил, что с помощью электрических и магнитных полей можно формировать электронные изображения. В 1931 г. Р. Руденберг подал патент на просвечивающий электронный микроскоп, который в 1932 г. построили М. Кнолль и Э. Руска, используя для фокусировки электронов магнитные линзы. В 1938 г. Э. Руска и Б. фон Боррис создали прототип промышленного электронного микроскопа, позволившего достичь разрешения 100 нм. В начале 40-х годов А. Пребус и Дж. Хиллер

4

в Торонтском университете (Канада) сконструировали первый электронный микроскоп высокого разрешения. Широкие возможности электронного микроскопа стали сразу же заметными, и его широким производством занялись фирма «Сименс-Хальске» в Германии и корпорация RCA в США. В конце 1940-х годов электронные микроскопы стали выпускать и другие компании.

Концепция современного электронного микроскопа была предложена в 1952 г. Чарльзом Отли, она смогла послужить основой для ряда технических усовершенствований, закончившихся конструированием промышленного варианта электронного микроскопа в середине 1960- х годов. В 1970 г. во Франции Дюпуи ввел в действие прибор с ускоряющим напряжением, равным 3,5 млн вольт, а в 1979 г. в Цюрихе Г. Биннигом и Г. Рорером был изобретен сканирующий электронный микроскоп. В 1986 г. Г. Бинниг и Г. Рорер (одновременно с Э. Руской) стали лауреатом Нобелевской премии по физике за создание электронного микроскопа.

В настоящее время существуют три основных типа электронных микроскопов. В 1930-х годах был сконструирован просвечивающий электронный микроскоп, позволяющий получить плоскостное изображение. В 1950-х годах – растровый (сканирующий) электронный микроскоп, способный создавать трехмерное изображение, т. е. получать пространственное изображение объекта. В 1980-х годах – растровый туннельный микроскоп.

Трансмиссионный просвечивающий электронный микроскоп

Похож на световой микроскоп, но вместо световых волн в нем используется пучок электронов, который ускоряется под действием сильного электрического поля. Источником электронов служит нагреваемый катод из гексаборида лантана или вольфрама. Для создания электрического поля катод находится под напряжением порядка 100000 В, которое фокусирует электроны в узкий пучок. Эта часть прибора получила название электронная пушка. Электроны продвигаются по колонне микроскопа, в которой создан высокий вакуум.

Световое изображение формируется оптическими линзами, а электронное – электрическими и магнитными полями. Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, действует как собирающая линза, поэтому фокусное расстояние можно изменять, изменяя ток. Каждый электрон характеризуется определенной

5

длиной волны. Следовательно, разрешающая способность электронного микроскопа определяется эффективной длиной волны электронов, которая зависит от их скорости, т. е. от ускоряющего напряжения, значит, чем оно больше, тем меньше длина волны и тем больше скорость электронов, а значит, выше разрешение.

Контраст в просвечивающем электронном микроскопе достигается при рассеивании электронов, проходящих через образец. Когда пучок электронов проходят через образец, часть из них рассеивается из-за столкновений с ядрами атомов образца, часть – из-за столкновений с электронами атомов, а часть проходят, не рассеиваясь.

Строение современного просвечивающего микроскопа

Современный просвечивающий микроскоп состоит из следующих основных систем: оптической, вакуумной и системы электропитания (рис. 1). Также имеется ряд приспособлений: система охлаждения линз, нагрева паромасляных насосов, устройство для фотографи-

рования.

Для движения электронов необходим вакуум. Предварительный вакуум создается работой механического (форвакуумного) насоса. В последующем с помощью паромасляных насосов создается высокий вакуум порядка 6‒7 10-4 Па.

Оптическая система состоит из источника электронов, ряда магнитных линз, люминесцентного экрана для наблюдения за изображением. Ток, который проходит через воль-

фрамовую нить, нагревает ее и вызывает выброс электронов. Такой источник электронов называют катодом накаливания. Поток электронов, испускаемый катодом, поступает в фокусирующий цилиндр, откуда направляется в отверстие анода (центральную апертуру), расположенное против точки изгиба катода. Электроны, проходящие через центральную апертуру, образуют электронный луч, который направляется вниз по колонне микроскопа, фокусируется первой магнитной линзой и освещает объект.

6

В специальный держатель помещают медную сетку, на которой находится исследуемый объект. Держатель можно плавно перемещать вверх-вниз и вправо-влево. Проходя через объект часть электронов, не отклоняется от своего пути, другая часть рассеиваются тяжелыми атомами образца, и выпадает из общего потока. Электроны, прошедшие объект, фокусируются второй (объективной), и третьей (проекционной) магнитными линзами и попадают на люминесцентный экран, который способен светится при их воздействии. Полученное изображение рассматривают через бинокулярный световой микроскоп (рис. 2).

Увеличение, которое можно получить в современных просвечивающих электронных микроскопах, составляет от 1000 до ~1000000 раз (при увеличении в миллион раз яблоко вырастает до размеров Земного шара). Изображение можно сфотографировать, если поднять люминесцентный экран для того, чтобы луч попал на фотографическую пластинку.

Рис. 2. Схема сканирующего электронного микроскопа

1 – катод: металлический электрод (обычно платиновый); 2 – анод: положительно заряженный электрод;

3 – конденсатор: электронная линза;

4 – шлюзовая камера для установки образца; 5 – объектив: электромагнитная линза;

6 – проектор;

7 – к вакуумному насосу;

8 – бетонное основание;

9 – фотографическая пластина;

10 – флюоресцентный экран;

11 – образец

Недостатки просвечивающих электронных микроскопов:

1)приходится работать с фиксированными материалами;

2)на экране изображение получается только плоским (двумерным);

3)воздействие тяжелых металлов может разрушать и видоизменять клеточные структуры.

7

Растровый электронный микроскоп

С помощью электронных линз пучок электронов фокусируется в пятно очень малых размеров, которое непрерывно обходит поверхность образца подобно лучу, обегающему экран телевизионной трубки. При бомбардировке объекта электронами пучка возникает электрический сигнал, который используется для формирования изображения на экране электронно-лучевой трубки или телевизионного кинескопа. Увеличение рассчитывается как отношение размера изображения на экране к размеру области, проходимой пучком на образце. В современных микроскопах диаметр пятна в нем не превышает 0,2 нм, но, обычно, он составляет единицы или десятки нанометров, следовательно, увеличение варьирует от 10 до 10 млн.

Высоковольтная микроскопия

Высоковольтные электронные микроскопы имеют ускоряющее напряжение от 300 до 400 кВ, что позволяет иметь более высокую проникающую способность, которая дает возможность получать объемные изображения толстых объектов и изучать целые клетки, не повреждая их. Микроскопы имеют небольшие размеры и поэтому могут быть установлены в обычном лабораторном помещении.

Растровый туннельный микроскоп

В растровом микроскопе в отличие от электронных микроскопов, рассмотренных выше, для фокусировки электронов применяются не магнитные линзы, а металлическое острие малого диаметра, которое является источником электронов. Электрическое поле создается в зазоре между острием и поверхностью образца. Ток тунлирования (число электронов, вытягиваемых полем из острия в единицу времени) зависит от расстояния между острием и поверхностью образца (обычно это расстояние меньше 1 нм). Если острие заканчивается одним атомом, то, можно сформировать изображение поверхности. Когда остриё перемещается вдоль поверхности препарата, ток меняется, это делает возможным получение изображение, отображающее рельеф поверхности образца.

8

Метод замораживания-скалывания

Метод «замораживания – скалывания» открывает новые возможности электронной микроскопии и позволяет исследовать тончайшие детали строения клетки, при этом в трансмиссионном электронном микроскопе получается объемное изображение (рис. 3). Когда используется стандартное замораживание, в клетках появляются кристаллы льда, заметно искажающие их структуру. Поэтому в данном методе клетки замораживают при температуре жидкого азота (-196 °С), и кристаллы льда не успевают образоваться, следовательно, клетка не испытывает деформаций.

Рис. 3. Схема метода замораживания скалывания

Полученый путем заморозки в жидком азоте блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода «замораживание – скалывание»). Затем следует операция травления (в вакуумной камере избыток льда удаляют возгонкой). После травления более четко просматривается рельеф в плоскости скола. На поверхность полученного образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов под углом к поверхности образца, что способствует появлению «эффекта тени», и поэтому изображение выглядит объемным.

Толщина оттененных образцов чрезмерно велика, а в трансмиссионном микроскопе электронный луч проникает только через очень тонкие срезы, поэтому органическую материю, подстилающую слой

9

металла, растворяют. В результате остается тонкий металлический отпечаток (или реплика) с поверхности образца, который и изучают в трансмиссионном микроскопе.

Используя этот метод можно изучать рельеф поверхности мембран клетки не измененных образцов. Показано, что общая организация клетки и ее компонентов при использовании этого метода сходна с тем, что мы видим при химической фиксации или при криотомии. С помощью этого метода удалось доказать, что клеточные мембраны не однородны по своей структуре, так как в их толщине можно увидеть глобулы интегральных белков.

Техника электронной микроскопии

Для исследования в электронном микроскопе препарат должен быть очень тонким и максимально контрастирован по сравнению с подложкой, которая является его опорой. Обычно используют препараты толщиной 2–200 нм, лежащие на тонких углеродных пленках, которые лежат на медной сетке (размер ячейки около 0,05 мм).

При приготовлении препарата для электронной микроскопии можно выделить следующие этапы работы:

1.Взятие материала.

2.Фиксация образцов.

3.Промывка образцов.

4.Обезвоживание.

5.Заливка кусочков.

6.Изготовление «полутонких» и ультратонких срезов.

7.Контрастирование.

Неточности, допущенные на любом этапе, сводят на нет всю ра-

боту. Брак обнаруживается только при изучении срезов в электронном микроскопе и не представляется возможным определить, когда была сделана ошибка.

Взятие материала

Для электронно-микроскопического исследования берутся материалы от лабораторных животных, биопсии, аутопсии, тканевых культур и т. д. При взятии материала необходимо иметь в виду, что посмертные изменения начинаются сразу после наступления смерти. Отличить нарушения ультраструктур, возникшие в результате фиксации, от изменений, наступивших при дальнейшей обработке материала, ча-

10