6 курс / Гастроэнтерология / 2021_Experimentalnaya_i_klinicheskaya_gastroenterologia

экспериментальная  и  клиническая  гастроэнтерология  |  № 185 (1)  2021

experimental & clinical  gastroenterology  |  № 185 (1)  2021

n

according to the formula: H=–∑pi log2 pi

xi

i=1

where pi=

∑n

x

i=1

i

Микробиота человека представляет собой сово-

пациентов отделения реанимации и интенсивной

купность множества микробиоцинозов, включает

терапии, находящихся на парентеральном питании

в себя десятки и сотни разнообразных видов и пре-

в зависимости от концентрации масляной кислоты

вышает число клеток всех органов и тканей чело-

в кале. Определена концентрация масляной кисло-

веческого организма. Является открытым органом

ты в кале 2,2 ммоль/г, выше которой соотношение

человека, оказывая влияние на жизненно-­важные

концентраций в кале уксусной, пропионовой и мас-

процессы в организме и выполняя пищеваритель-

ляной кислот (С2: С3: С4) стабильно и составляет

ную, энергетическую, морфокинетическую (энер-

72:17:11, а значение структурного индекса 0,56 ед.

гообеспечение эпителия, тепловое обеспечение

При снижении концентрации масляной кислоты

организма, регуляция перистальтики кишечника,

в кале ниже 2,2 ммоль/г наблюдается линейная

дифференцировки и регенераций эпителиальных

тенденция к увеличению доли уксусной кислоты

тканей слизистой оболочки), биосинтетическую,

в соотношении С2: С3: С4 и снижение структур-

иммуномодулирующую функции, а также обеспе-

ного индекса. Отмечаемую тенденцию снижения

чивает колонизационную резистентность слизи-

продукции летучих жирных кислот анаэробной

стой оболочки кишечника и противоинфекцион-

микрофлорой при снижении концентрации масля-

ную защиту. Микрофлора кишечника участвует

ной кислоты в кале ниже 2,2 ммоль/г можно считать

в ферментации нерасщеплённых ранее компо-

важным метаболическим предиктором разруше-

нентов пищи, главным образом углеводов, олиго

ния метаболических связей между представите-

и полисахаридов, жиров и белков. Метаболиты

лями индигенной микрофлоры и перестройкой

микрофлоры, образующиеся в результате этого

микробного пищеварения по пути аэробного сбра-

процесса, оказывают существенное влияние на со-

живания [6].

стояние здоровья человека. Различия микробного

Известно также, что выявляются существенные

состава кишечника и метаболические особенности

различия детских и взрослых типов микрофлоры.

отдельных представителей микробиома влияют на

Ранее рождение ребенка означало переход его от

предрасположенность к метаболическим наруше-

«стерильных» условий внутриутробного развития

ниям. Одним из самых важных метаболитов яв-

к существованию в разнообразном мире микробов.

ляется масляная кислота, которая необходима для

Однако, в современных исследованиях начали рас-

нормального существования и функционирования

сматривать другую теорию – о «внутриутробной

клеток слизистой оболочки кишечника, является

колонизации матки» [7], которая освещает тот факт,

важным энергетическим субстратом и регулято-

что внутриутробные условия пребывания плода

ром пролиферации и дифференцировки энтеро-

нестерильны, т. к. при микробиологическом иссле-

цитов, а также влияет на процессы всасывания

довании околоплодных вод, плаценты, пуповин-

воды, натрия, хлора, кальция и магния. Обладает

ной крови и мекония обнаруживались бактерии

антиканцерогенным, иммуномодулирующим

Enterococcus, Escherichia, Leuconostoc, Lactococcus

и противовоспалительным действием. [1, 2, 3].

и Streptococcus.

Обычно вместе с концентрацией масляной кисло-

Выделяют 3 фазы становления нормальной

ты определяют также и другие короткоцепочечные

микрофлоры у новорождённого. В первую фазу

кислоты – уксусную, пропионовую, валериановую,

фекальная микрофлора представлен анаэроба-

капроновую и их изомеры, по которым устанавли-

ми: Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. adoles-

вают особенности функциональной активности

centis, B. catenulatum spp., Lactobacillus crispatus

микробиоценоза кишечника. Соотношение ук-

и Lactobacillus jensenii. Во вторую – начинают пре-

сусной, пропионовой, масляной кислот является

обладать факультативно-­анаэробные бактерии:

важным индикатором целостности микробного

Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus,­ Micro­

сообщества кишечника. При симбиотических от-

coccus Gemella, Globicatella, Granulicatella, Rothia;

ношениях микроорганизмов индигенной микро-

Corynebacterium, Bacillus, Е.coli, Enterobateriaceae.

флоры в микробно-тканевом комплексе толстой

Втретьюфазуиндигеннаяфлораобогащаетсязасчет

кишки соотношение этих метаболитов сохраняет

облигатных анаэробов: Bacteroides, Parabacteroides,

постоянство в рамках небольшого интервала кон-

Veillonella, Clostridium, Fusobacterium, Ruminococcus,

центраций. Отношение суммы концентраций про-

Eubacterium, Eggerthella, Actinomyces, Collinsellа,

пионовой, масляной, валериановой, капроновой

Propionibacterium. Постепенно, с поступлением

кислот и их изомеров к концентрации уксусной

бактерий с грудным молоком и с окружающих

кислоты называется структурным индексом [4].

предметов продолжается физиологическая бакте-

Структурный индекс позволяет оценить соотно-

риальная транслокация кишечника у новорожден-

шение метаболической активности анаэробной,

ного, исходом которой является формирование

индигенной микрофлоры кишечника к общей ме-

бактериальной биопленки. Под бактериальной

таболической активности всех микроорганизмов

биопленкой подразумевают микробное сооб-

микробно-­тканевого комплекса толстой кишки

щество, в котором прикрепленныек субстрату(-

и охарактеризовать структуру микробного сооб-

муцин – пептидогликан бокаловидных клеток

щества. Ключевая роль масляной кислоты в под-

эпителия кишечника) и друг к другу бактерии

держании целостности микробного сообщества

окружены матриксом, продуцируемым микро-

и ее критическая концентрация в кале определены

организмами в соответствии с уровнем разви-

в работе [5], где исследована структура метаболи-

тия популяции и условиями транскрипции ге-

ческой активности микробиоценоза кишечника

нов [8]. Бактериальная биопленка способствует

клиническая  гастроэнтерология  |  clinical  gastroenterology

выживанию микроорганизмов в определенном

родившихся от матерей с СД, в первые 28 дней

биотопе организма хозяина и зависит от QS-

после рождения представляет особый интерес. Так,

системы (Quorum Sensing – чувство кворума).

формирование нормальной микрофлоры ребенка

В зависимости от активности данной регулятор-

зависит от многих факторов, а именно от здоровья

ной системы, происходит внутрипопуляционный

матери до и во время беременности, состояния её

информационный обмен бактериальных клеток

родовых путей, особенностей микробного загряз-

между собой (регуляция экспрессии генов) с ис-

нения окружающей среды, активности неспецифи-

пользованием низкомолекулярных сигнальных

ческих защитных механизмов (бактерицидность

молекул – аутоиндукторов [9]. Еще внутриутробно

и резистентность кожных покровов, активность

у плода формируется иммунологическая память

макрофагов, секреция лизоцима, пероксидазы),

о микробиоценозе матери. Кишечная микрофлора

степень активности пассивного иммунитета и дру-

влияет на становление иммунной системы, со-

гих. В связи с этим представляло интерес изучить

зревание CD4+, CD8+ лимфоцитов и дендритных

особенности микробиома кишечника у детей, ро-

клеток. При нарушении микробиоценоза у матери,

дившихся от матерей с гестационным сахарным

ее условно-­патогенные и патогенные аллохтонные

диабетом (ГСД).

микроорганизмы становятся индигенными для

Цель исследования. Совершенствовать раннюю

плода. А так как во время раннего периода жизни

диагностику нарушений микроэкологии кишечни-

ребенка иммунная система слишком незрелая

ка у грудных детей, путем определения видового

для ликвидации кишечных микроорганизмов это

состава и функциональной активности микрофло-

становится причиной нарушения становления

ры кишечника для прогнозирования состояния

гармоничного микробиоценоза. В связи с этим из-

здоровья детей, родившихся от матерей с сахарным

учение состояния микробиоты кишечника у детей,

диабетом.

Материал и методы

= − ∑

Проведено исследование состояния микробио-

2

ценоза кишечника у 60 грудных детей в возрасте

= 1

1–28 дней, из них 22 ребенка от здоровых матерей

=

(контрольная группа) и 38 от матерей, больных ГСД

где 

∑ = 1

(исследовательская группа). Исследовали: видовой

состав микробиоценоза кишечника; его функцио-

и соответствует числу видов микроорганизмов в ми-

нальное состояние по концентрациям короткоце-

кробном сообществе кишечника. Нормированный

почечных жирных кислот (КЖК).

индекс Шеннона имеет разброс значений от 0 до 1,

Видовой состав изучали методом ngs-секвени- что удобно для интерпретации состояния микро-

рования кала, концентрацию КЖК методом га-

биоценоза. Увеличение биоразнообразия микроб-

зо-жидкостной хроматографии подкисленного

ного сообщества связано с увеличением дисбио-

супернатанта кала. Мерой дизбиоза кишечника

тических нарушений микробиоценоза кишечника.

считали биоразнообразие микробного сообщества,

Статистический анализ полученных данных про-

которое в биологии количественно определяется

водился с использованием программных пакетов

индексом Шеннона и рассчитывается по формуле:

Statistica 8.0. и MS OfficeExсel 2010.

Результаты исследования и обсуждение

Концентрации короткоцепочечных жирных кислот

кислоты может проникать в кровеносное русло

и их расчетные индексы в исследуемых группах

и оказывать токсическое воздействие на нервную

представлены в табл. 1.

ткань организма человека.

В табл. 1. Представлено, что между показате-

Функциональная активность микробиоценоза

лями функциональной активности микрофлоры

напрямую зависит от филотипа микробиоцено-

кишечника исследовательской группы и группы

за и его качественного состава и взаимодействия

сравнения есть статистическая значимость по по-

бактерий между друг другом и макроорганизмом,

казателям концентрации валериановой и изока-

начиная с раннего этапа формирования. Известно,

проновой кислот. Валериановая (син. пентановая)

что 2,2 ммоль/г масляной кислоты в кале являет-

является одной из тяжелых короткоцепочечных

ся критической концентрацией для микробного

жирных кислот, обладает слабым спазмолитиче-

сообщества, ниже которой вероятность метабо-

ским действием и стимулирует моторику толстой

лических связей индигенной микрофлоры рез-

кишки. Наряду с изовалериановой измеряется для

ко снижается [5]. Используем этот критерий для

характеристики функциональной активности ми-

определения частоты встречаемости микробиоце-

кробиоты кишечника. Изокапроновая кислота, как

нозов кишечника, характерных для симбионтных

продукт переработки белков микробиотой кишеч-

взаимоотношений макроорганизм – микробиота

ника, свидетельствует о повышении протеолити-

в исследуемых группах в зависимости от возраста

ческой активности, что в свою очередь указывает

детей (табл. 2.). Этапы становления микроэкологии

на преобладание гнилостных процессов в просве-

кишечника у наблюдаемых детей в первые дни жиз-

те толстой кишки. Также, изоформа капроновой

ни после рождения представлены в Табл. 2.

экспериментальная  и  клиническая  гастроэнтерология  |  № 185 (1)  2021

experimental & clinical  gastroenterology  |  № 185 (1)  2021

клиническая  гастроэнтерология  |  clinical  gastroenterology

Из табл. 2. следует, что в исследовательской

видов микроорганизмов и классов к которым они

группе заселение кишечника микроорганизмами

относятся в титре выше 103 КОЕ/г и интенсивность

начинается на 2 е сутки, а в группе сравнения в 1 е

бактериальной колонизации по среднему Lg КОЕ/г

сутки. Это может быть связано с тем, что нормаль-

(табл. 3.).

ная индигенная микрофлора с самого рождения

В табл. 3. представлены данные, из которых сле-

сохраняет этапность заселения кишечника, фор-

дует, что чаще других в исследовательской группе

мирует крепкие симбионтные отношения с ма-

и группе сравнения встречаются микроорганизмы

кроорганизмом, что приводит к регулируемому

класса Firmicutes (73,7% и 90,9% соответственно).

становлению здорового микробиоценоза. Между

Но у детей, рожденных от матерей с ГСД, при ана-

тем, к 5 му дню показатели выравниваются в обеих

лизе качественного и количественного состава

группах, но за счет разных механизмов.

микроорганизмов: бактерии формирующие ин-

Для оценки видового состава микробиоцено-

дигенную микрофлору (Firmicutes, Bacteroidetes,

за кишечника сравним частоты встречаемости

Actinobacteria) встречаются реже. Так, только

таблица 3 (продолжение)

Частота встречаемости выше 103 КОЕ/г

Интенсивность бактериальной

table 3 (continued)

колонизации, средний Lg КОЕ/г

Класс/вид

Статисти-

Статисти-

микроорганизма

ИГ

ГС

ческая

ИГ

ГС

ческая

значимость,

значимость,

p<0,05

p<0,05

Prevotellaspp.

-

-

-

2,5

p<0,01

[2,5–2,5]

Alistipesspp.

-

9,09

0,003

-

3,3

p<0,01

[3,3–3,3]

Proteobacteria

54,55

47,37

0,477

5,7

2,5

0,377

[2,1–6,7]

[1,9–5,5]

Enterobateriaceae

54,55

47,37

0,477

6,4

2,95

0,131

[2,3–6,7]

[1,9–5,5]

E. coli

45,45

42,11

0,720

5,1

4

0,485

[1,3–5,7]

[1,7–4,9]

Pseudomonasspp.

-

-

1,9

1,9

0,74

[1,9–2,2]

[1,9–2,1]

Bdelovibrio

-

-

-

0,7

p<0,01

[0,7–0,7]

Suterellawadsworthensis

-

-

2,8

-

p<0,01

[2,8–2,8]

DialisterAlisonella

0,008

0

0

Megaspherae

5,26

18,18

0,22

[0–0]

[0–1,8]

Vellonella

один вид бифидобактерий Bifidobacterium bif-

В целом, микрофлора исследовательской группы

idum в исследовательской группе, к B. Dentium,

представлена большим видовым разнообразием

B. Adolescentis, B. Longum, Lactobacillaceae в группе

микроорганизмов, что указывает на снижение

сравнения. В меньшем количестве Enterococcus

симбионтных отношений микробиома с макроор-

spp. Staphylococcusspp. Streptococcus, являющихся

ганизмом. Колонизация отдельных видов микро-

индигенной флорой на этапе подготовки внутри-

организмов в исследовательской группе достига-

кишечных условий к анаэробным, активно сни-

ет 103–104 микроорганизмов, тогда как в группе

жают содержание кислорода в полости кишки;

сравнения 105–106. Это может быть связано с тем,

и обеспечивают колонизационную резистент-

что для подготовки условий для колонизации ин-

ность слизистой оболочки кишечника. И в боль-

дигенной флорой кишечника у детей, рожденных

шем E. coli, которая конкурирует с патогенны-

от матерей с ГСД, необходимо затратить больше

ми микроорганизмами за места прикрепления

усилий, чем у детей от матерей без сахарного ди-

к эпителиальным клеткам толстой кишки и вы-

абета. Известно, что микробиоценоз имеющий

рабатывает колицины – антибиотикоподобные

симбионтные отношения с макроорганизмом более

вещества, тормозящие рост патогенных микро-

качественно отлаживает свою работу уже с на-

организмов.

чальных этапов заселения в кишечнике. В тоже

Также в отличие от группы сравнения у детей

время, активный рост микроорганизмов у детей от

от матерей с ГСД в меньшем количестве выделя-

матерей с сахарным диабетом, начиная со вторых

лись бактерии, представители нормальной ми-

суток жизни может приводить формированию диз-

крофлоры: Actinomyces, Parabacteroides, Veillonella,

биоза, т. к. идет активная борьба отдельных видов

Bacteroides, разлагающие сложные растительные

бактерий за питательный субстракт. При этом уве-

полисахариды (крахмал, целлюлоза, ксиланы, пек-

личение биоразнообразия может сопровождаться

тины) и играющие важную роль в метаболизме

выравниванием показателя интенсивности бак-

белка. Далее, во время качественного анализа со-

териальной колонизации, что приведет к быстрой

ставляющих микробиоценоза у детей исследова-

смене доминирующего вида микроорганизма без

тельской группы были выделены бактерии типа

участия макроорганизма.

Firmicutes относящиеся к патогенным: Clostridium

Проведенные нами корреляции между основ-

dificile, вызывающие воспаление слизистой кишеч-

ными показателями функциональной активности

ника при ослаблении местного иммунитета и на-

микробиоценоза кишечника и классами микроор-

рушении биопленки, Erysipelotrichaceae, влияющие

ганизмов кала детей исследуемых групп представ-

на метаболизм липидов хозяина. Преобладающие

лены в табл. 4.

бактерии типов Proteobacteria и Tenericutes вклю-

В табл. 4. показано, что в исследовательской

чающие большое количество патогенных бактерий.

группе отмечается прямая корреляционная связь

Протеобактерии имеют высокий потенциал для

концентрации масляной кислоты с общим уровнем

чрезмерного роста и кишечного доминирования,

ЛЖК и структурным индексом. Также обнаружена

что может приводить к воспалительным заболе-

прямая корреляционная связь интенсивности бак-

ваниям кишечника и нарушению усвоения пита-

териальной колонизации Proteobacteria с Firmicutes

тельных веществ, обмена веществ.

и Bacteroidetes. Сильные корреляционные связи

экспериментальная  и  клиническая  гастроэнтерология  |  № 185 (1)  2021

experimental & clinical  gastroenterology  |  № 185 (1)  2021

функциональной активности микробиоценоза ки-

баланс микробиоты в тонкой кишке, с последую-

шечника, но с отрицательным значением. Низкая

щим нарушением пищеварения. Что в свою очередь

интенсивность бактериальной колонизации

ведет к дефициту микронутриентов, необходимых

условно-­патогенной и патогенной флорой ведет

для полноценного роста и развития детей.

к формированию здорового микробиома.

Далее рассмотрели распределение концентрации

Высокое биоразнообразие представителей

масляной кислоты относительно индекса Шеннона

условно-­патогенной флоры у детей, рожденных

(рис. 1).

от матерей с ГСД, отрицательная корреляционная

На рис. 1. отмечена линия регрессии концен-

связь с углеводами кала, свидетельствуют о том,

трации масляной кислоты относительно индекса

что даже при наличии достаточных показателей

Шеннона с указанием 95% доверительного интер-

масляной кислоты, вырабатываемой бактериями,

вала. Также показано, что дети исследовательской

среда недоокисляется, что приводит к повыше-

группы в основной массе старше 2 дней имеют вы-

нию рН и росту гнилостной флоры (клостридии,

сокие (более 0,5) значения индекса Шеннона и зна-

энтеробактерии).

чения концентраций масляной кислоты 5 ммоль/г

Таким образом в кале обнаруживаются более

и выше. Таким образом, дети, рожденные от мате-

высокие показатели изоформ КЖК, свидетельству-

рей с ГСД на 2й день жизни достигают нормально-

ющие о повышении протеолитической активности

го уровня масляной кислоты за счет увеличения

бактреий. В процессе разложения белков и амино-

микробного разнообразия. Нарушение микроэ-

кислот в результате ферментативного гидролиза

кологии кишечника (МЭК) в сторону увеличения

гнилостных бактерий образуются токсичные ко-

факультативной и транзиторной микрофлоры,

нечные продукты – аммиак и сероводород. Идет

помимо изменения физиологических функций

повреждение слизистой толстой кишки, наруша-

могут сопровождаться: транслокацией бактерий

ются защитные функции биопленки, формируется

с развитием эндогенных инфекционных процес-

хроническое воспаление, слизистая становится

сов (вплоть до гнойно-­септических); снижением

уязвимой к воздействию токсинов. Одновременно,

общей иммунологической резистентности; раз-

повышение рН среды в толстой кишке ведет к из-

витием аллергических и иммунокомплексных

менению рН среды в верхних отделах желудочно-­

реакций; формированием патогенных клонов

кишечного тракта (ВОПТ), а значит, нарушается

бактерий и др.

Изменение микробиоценоза кишечника у детей

будет сформировано анаэробное микробное сооб-

происходит благодаря поэтажному заселению

щество индигенной микрофлоры. Благодаря срав-

и формированию особой зоны, прилегающей непо-

нению частот встречаемости концентрации мас-

средственно к эпителию толстой кишки, в которой

ляной кислоты относительно ее критического