Аллостерические ферменты - ферменты, имеющие аллостерический
центр, расположенный не в активном центре.
Аллостерический центр (комбинация радикалов нескольких аминокислот)
-роль аллостерических центров в регуляции активности фермента
-положительные и отрицательные модификаторы аллостерических центров (промежуточные метаболиты обмена веществ и лекарственные препараты).
Изоферменты – группа ферментов, катализирующих одну химическую реакцию, но обладающих различными свойствами:
-аминокислотным составом,
-сродством к субстрату,
-электрофоретической подвижностью,
-каталитической активностью,
-локализаций в тканях.
Пример изоферментов - лактатдегидрогеназы (ЛДГ):
-реакции катализируемые изоферментами ЛДГ
|
|
|
|
|
|
|
ЛДГ4, ЛДГ5 |
|
НАД+ |
|
|
|
|
Пируват + НАДН2 |
|
Лактат + |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
ЛДГ1, ЛДГ2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Распределение изоферментов ЛДГ |
|
Обозначение |
|
Название |
||||||
разных тканей при электрофорезе |
Набор |
|
изофермента, |
|||||||
набора |
|
|||||||||
|
|
|
|
Скелетные |
субъединиц |
|
принятое в |
|||
Миокард |
|
субъединиц |
|
|||||||
|
мышцы |
|
|
медицине |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Н4 |
|
ЛДГ1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
М1Н3 |
|
ЛДГ2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
М2Н2 |
|
ЛДГ3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
М3Н1 |
|
ЛДГ4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
М4 |
|
ЛДГ5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10
- биологическое значение распределения изоферментов ЛДГ по органам и тканям:
-ЛДГ1 преимущественно в миокарде (аэробных условия функционирования),
-ЛДГ5 преимущественно в скелетных мышцах (функционирующих не редко в анаэробных условиях);
-диагностическое значение определения изоэнзимного спектра сыворотки крови при различных заболеваниях:
-инфаркт миокарда – некроз кардиомиоцитов – вымывание ЛДГ в
плазму – повышение активности преимущественно ЛДГ1 в плазме крови;
-гепатит - ………….?
Полиферментные системы (совокупность ферментов, объединенных
единым метаболическим процессом).
Метаболизм – совокупность всех протекающих в клетках химических реакций.
В клетках продукт одной реакции служит субстратом для другого энзима, и таким образом формируются метаболические пути (“конвейеры”). Структура метаболических путей: они бывают линейные (гликолиз) и циклические (ЦТК).
Реакции, катализируемые энзимами, согласованы между собой по времени, скорости, разделены по месту действия.
Компартментализация ферментов:
-в цитоплазме – ферменты гликолиза;
-в лизосомах – гидролитические ферменты;
-в ядре – ферменты синтеза ДНК и РНК;
-в матриксе митохондрий – ферменты ЦТК;
-в мембране митохондрий – ферменты переноса электронов и протонов. Органоспецифичность ферментов:
-аргиназа – синтез мочевины в печени;
-кислая фосфатаза – гидролиз фосфорных эфиров в простате;
-креатинкиназа МВ – биоэнергетика миокарда;
-GOT – трансаминирование в миокарде;
-GPT - трансаминирование в печени.
Формы организации полиферментных систем:
-функциональные (объединены по функции, свободно диффундируют в цитоплазме клетки - энзимы гликолиза),
-структурно-функциональные (объединены по функции и закреплены на структуре - энзимы дыхательной цепи митохондрий),
-смешанные (часть ферментов метаболического пути свободна в матриксе митохондрий, а другая часть закреплена на мембране - энзимы ЦТК).
Теория катализа (термодинамика катализа)
-все процессы самопроизвольно протекают в сторону уменьшения свободной энергии (второй закон термодинамики),
11
- в любой реакционной смеси все молекулы значительно различаются по содержанию потенциальной и кинетической энергии:
число
молекул
энергия молекул
-скорость химической реакции зависит от энергии исходных веществ и величины энергетического барьера (молекулярные силы отталкивания),
-чтобы повысить скорость химической реакции, необходимо увеличить энергию реагирующих веществ (сообщить энергию активации) либо уменьшить величину энергетического барьера,
-энергия активации (энергия, которая необходима, чтобы все молекулы 1 моля вещества могли бы преодолеть энергетический барьер и вступить в химическую реакцию),
графическое изображение энергии реагирующих веществ, энергии активации и энергетического барьера:
|
энергетический |
|
G |
барьер без |
|
катализатора |
||
|
энергия |
|
|
активации без |
|
|
катализатора |
энергетический |
|
энергия |
барьер в |
|
активации в |
|
|
присутствии |
|
|
присутствии |
|
|
катализатора |
|
|
катализатора |
|
|
|
|
|
Средняя энергия |
|
|
исходных |
|
|
вещества (S) |
|
|
энергия продуктов |
|
|
реакции (Р) |
|
динамика химической реакции (t)
12
способы повышения скорости химической реакции:
-температура (повышение температуры на 10 0С увеличивает скорость реакции в 2-3 раза),
-катализаторы: неорганические и органические (ферменты).
Сходства и отличия в действии ферментов и неорганических катализаторов
Сходства:
-катализируют энергетически возможные реакции,
-не изменяют направление реакций,
-не смещают равновесие реакций,
-ферменты и неорганические катализаторы не расходуются в ходе химической реакции.
Отличия:
-энзимы обладают значительно большей каталитической активностью,
-энзимы действуют в «мягких» условиях (рН, температура, давление),
-энзимы обладают специфичностью действия,
-энзимы являются катализаторами с регулируемой активностью.
Гипотезы механизма действия ферментов
Адсорбционная (Бейлис, Варбург)
Гипотеза промежуточных соединений (Михаэлис, Ментен):
-сближение и ориентация субстрата и активного центра энзима,
-образование E-S комплекса, эффект напряжения (индуцированное напряжение и дестабилизация, при которых энергетический барьер химической реакции становится ниже),
-акт катализа (кислотно-щелочной или ковалентный):
-кислотно-основной катализ (фермент и субстрат реагируют, как кислота и щелочь),
-ковалентный катализ (при взаимодействии фермента и субстрата образуются ковалентные связи, которые не устойчивы и быстро распадаются с образованием новых продуктов реакции),
-выход конечных продуктов реакции из активного центра фермента.
13
Кинетика ферментативных реакций
Кинетика химических реакций зависит от: |
|
- |
количества субстрата, |
- |
количества фермента, |
- |
температуры, |
- |
рН среды, |
- |
активности фермента, |
- и многих других причин.
Влияние количества субстрата (Кm - константа Михаэлиса): |
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
- Кm - это концентрация субстрата, при |
|
||||||
|
|
|
которой |
скорость |
химической реакции |
|
||||
|
|
|
составляет |
1⁄2 |
от |
максимально |
|
|||
|
|
|
возможной.Km для каждого энзима |
|
||||||
|
|
|
величина постоянная, она отражает |
|
||||||
|
|
|
сродство энзима и субстрата; |
|
|
|||||
|
|
|
- |
Кm гексокиназы=0,1 мМ ⁄л, |
|
|
||||
|
|
|
- Кm глюкокиназы=10 мМ ⁄л. |
|
|
|||||
|
|
|
- Биологических |
смысл |
различного |
|
||||
|
|
|
сродства |
|
(Кm) |
гексокиназы |
и |
|
||
|
|
|
глюкокиназы к глюкозе и распределения |
|
||||||
|
|
|
этих ферментов по тканям (сохранение |
|
||||||
|
|
|
гомеостаза глюкозы). |
|
|
|
||||
|
Влияние количества фермента: |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
||||||||
|
|
- Зависимость прямо пропорциональная, т.е. |
||||||||
реакции |
|
|
чем |
больше фермента в клетке, тем выше |
||||||
|
|
скорость ферментативной реакции. |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
||||||
|
|
- Количество энзима в клетке зависит от ее |
||||||||
скорость |
|
|
потребности в ферменте (гипотеза Жакоба и |
|||||||
|
|
небольшая часть энзимов. |
|
|
|
|||||
|
|
|
Моно. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
- В |
покое |
в |
клетке функционирует |
лишь |
||||
|
|
- В ситуации стресса в кинетике химической |
||||||||
|
|
|
реакции участвует максимальное количество |
|||||||
|
|
|
энзимов, что обеспечивает адаптацию клетки |
|||||||
|
количество фермента |
|
к экстремальным условиям. |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
14
Влияние температуры,
Влияние рН среды,
-При увеличении температуры до 400С
скорость ферментативной реакции возрастает (повышение температуры на 10 0С увеличивает скорость реакции в 1,5-2 раза),
-возрастание скорости ферментативной реакции при повышении температуры используется организмом как защитный механизм,
-понижение температуры (гипотермия организма и его отдельных тканей) используется в медицине для замедления ферментативных реакций при консервации органов и выполнении хирургических операций на «сухом» органе.
-Выше 400С скорость некоторых ферментативных реакций замедляется, т.к. начинается денатурация фермента.
-Каждый фермент проявляет максимальную активность при оптимальном для него значении рН среды.
-Оптимум рН среды для большинства ферментов лежит в нейтральной среде. Имеются исключения:
-пепсин – оптимум рН=1,5-2,
-щелочная фосфатаза – оптимум рН=9-10.
-Изменение рН в организме при патологиях нарушает функцию энзимов (изменяется степень ионизации функциональных групп активного и аллостерического центров и их архитектоника).
Принципы регуляции метаболических путей
Изменением количества фермента (на уровне транскрипции и трансляции и протеолиза белка фермента);
Доступностью молекул субстрата и кофермента (т.е. проницаемостью мембран, а также активностью транслоказ);
Изменением каталитической активности фермента (наиболее эффективный и быстрый способ регуляции метаболизма).
Активность фермента
Может увеличиваться или понижаться.
15
Активность фермента в клетке изменяется под действием на него активаторов и ингибиторов.
Понятие об активаторах и ингибиторах ферментов:
-активатор увеличивает скорость ферментативной реакции,
-ингибитор уменьшает скорость ферментативной реакции.
Использование ингибиторов и активаторов в медицине (лекарственные препараты в большинстве случаев являются активаторами или ингибиторами ферментов).
Активирование ферментов
Способы активирования ферментов:
-Витаминами и коферментами,
-субстратами,
-ионами металлов,
-активацией профермента (профермент активный фермент: частичный протеолиз пепсиногена с образованием активного пепсина),
-активацией по принципу ковалентной модификации
(фосфорилирование/дефосфорилирование ферментов: фосфорилаза активируется, а гликогенсинтетаза ингибируется в первом случае и наоборот при дефосфорилировании),
- ассоциацией и диссоциацией протомеров: например, протеинкиназа неактивная – тетрамер (2R-регуляторные и 2G-каталитические субъединицы) + 4 ц-АМФ диссоциация олигомера с освобождением 2G субъединиц, обладающих каталитической активностью.
-положительными модификаторами аллостерических ферментов.
Ингибирование ферментов
Виды ингибирования (необратимое и обратимое)
Необратимое ингибирование (активность фермента не восстанавливается);
например при действии диизопропилфторфосфата (ДФФ) на ацетилхолинэстеразу:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CH3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
CH3 |
|
CH3 |
|
|
|
|
|
|
|
CH3 |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
C |
|
|
|
|
|
|
C |
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ФЕРМЕНТ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
ФЕРМЕНТ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
F |
|
|
|
|
P |
|
|
O |
|
CH2O |
|
|
|
|
P |
|
|
O |
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
CH2O H |
|
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
HF |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
CH3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
CH3 |
|
CH3 |
|
|
|
|
|
|
|
CH3 |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
C |
|
|
|
|
|
|
C |
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
ДФФ |
НЕАКТИВНЫЙ |
|
|
16 |
ФЕРМЕНТ |
ацетилхолин является медиатором при синаптической передаче нервного импульса,
холинэстераза катализирует распад ацетилхолина, прерывая передачу нервного импульса,
при необратимом ингибировании холинэстеразы передача нервного импульса не прерывается, что вызывает тетанию и паралич дыхания,
на принципах необратимого ингибирования основано действие многих боевых отравляющих веществ,
Обратимое ингибирование (после отделения ингибитора от фермента его активность восстанавливается)
-Виды обратимого ингибирования:
конкурентное ингибирование:
действие малоновой кислоты на сукцинатдегидрогеназу
-Конкурентный ингибитор сходен по структуре с субстратом.
-Субстрат и ингибитор конкурируют за активный центр фермента образуются комплексы ЕS и EI. Последний препятствует взаимодействию энзима с истинным субстратом.
-Конкурентными ингибиторами могут быть метаболиты (например, ЩУК, малат), антиметаболиты, антикоферменты, антивитамины и лекарственные препараты (например, прозерин, физостигмин, присоединяясь к активному центру ацетилхолинэстеразы, препятствуют гидролизу ацетилхолина и усиливают проведение нервного импульса при лечении мышечной дистрофии.)
неконкурентное ингибирование:
|
|
S |
|
S |
H |
- |
S |
Е |
|
|
Hg2+ |
|
|
S |
|
S |
H |
|
|
|
|
||
|
|
Hg2+ |
I |
Е + S + I ———————— ESI
-Субстрат и ингибитор не конкурируют за активный центр фермента.
-Ингибитор обратимо изменяет структуру энзима. В связи с этим, последний не может эффективно катализировать реакцию превращения субстрата.
-Неконкурентными ингибиторами могут быть промежуточные метаболиты, которые ингибируют энзим по принципу отрицательной обратной связи, а также ионы тяжелых металлов в небольших количествах.
17
субстратное ингибирование:
- Избыток субстрата ингибирует энзим, т.к к активному центру фермента присоединяются одновременно 2 молекулы субстрата.
- Ингибирование снимается простым уменьшением концентрации субстрата.
E |
|
|
|
|
|
|
|
|
S |
||
|
2S |
|
|||
|
|
Е |
|||
|
|
|
|
||
S
Е+ S + S ———————— ESS
Аллостерическая регуляция активности ферментов
(ферменты "дирижеры", регуляторные, ключевые ферменты )
-возможна в группе ферментов с аллостерическими центрами,
-аллостерическими эффекторами в организме являются метаболиты, гормоны, металлы, коферменты,
-благодаря аллостерической регуляции активности энзимов, аллостерические ферменты являются «дирижерами» метаболических процессов, как правило, катализируют самые медленные реакции и располагаются в начале и конце метаболического пути,
-пример аллостерической регуляции (энзимы гликолиза):
|
|
Схема гликолиза: |
|
— |
Е1 |
Е2 |
Е3 |
Е10 |
Е11 |
гг-6-ф ф-6-ф ф-1,6-диф …… феп пируват лактат
аллостерическими ферментами этого пути являются Е3 и Е10 (фосфофруктокиназа и пируваткиназа),
Е3 и Е10 , увеличивая или уменьшая свою активность, контролируют скорость гликолиза,
положительными модификаторами Е3 и Е10 являются АМФ и АДФ,
отрицательными модификаторами Е3 и Е10 являются АТФ, цитрат и ВЖК.
18
биологический смысл аллостерической регуляции (клетка тонко реагирует на изменения окружающей среды и в режиме саморегуляции изменяет метаболизм в нужном направлении),
ингибирование по принципу отрицательной обратной связи
(ретроингибирование) – разновидность аллостерической регуляции:
-осуществляется продуктами реакции (лактат); они ингибируют энзим (Е11) , катализирующий их образование.
Специфичность действия ферментов:
—В основе специфичности лежит структурное и химическое соответствие субстрата и активного центра фермента.
Гипотезы:
-гипотеза Фишера ("ключ-замок"),
-гипотеза Кошланда (вынужденного соответствия).
Виды специфичности ферментов: субстратная и каталитическая.
субстратная специфичность (в порядке убывания степени специфичности):
-стереохимическая – фермент специфичен к стереоизомерам (L- аминокислоты, d-сахара),
-абсолютная субстратная специфичность – фермент катализирует превращение только одного субстрата (уреаза катализирует превращение только мочевины, аргиназа – распад аргинина),
-абсолютная групповая специфичность – фермент специфичен к функциональным группам субстрата (алкогольдегидрогеназа – катализирует окисление различных спиртов),
-относительная групповая специфичность - фермент специфичен к химическим связям определенной группы субстратов (пепсин, трипсин
-катализируют пептидные связи белков),
-относительная субстратная специфичность- фермент мало специфичен
(монооксидазы в присутствии цитохрома Р450 окисляет тысячи различных веществ, лекарств, ядов).
–Каталитическая специфичность, например глюкозо-6-Ф является субстратом 4 энзимов: глюкозо-6-фосфатазы, фосфогексоизомеразы, фосфоглюкомутазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
Номенклатура ферментов (название ферментов):
тривиальная (произвольная, исторически сложившаяся: пепсин, трипсин, химотрипсин),
номенклатура, предложенная Дюкло (название субстрата с заменой его окончания на «аза»: сахароза- сахараза, лактоза-лактаза),
предложения Международного конгресса по энзимологии (1961 г.):
-рабочее название фермента (название субстрата + тип реакции + окончание «аза»: лактатдегидрогеназа = ЛДГ1-5?) – удобное для повседневного использования.
19