2 курс / Биохимия / Митин_Ю_А_Лабораторная_диагностика_аллергических_заболеваний_Методические

Ю.А. Митин

Приложение N 2 к Порядку оказания медицинской помощи больным с аллергическими заболеваниями и болезнями, ассоциированными с иммунодефицитами, утвержденному Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 4 февраля 2010 г. N 60н

Рекомендуемые штатные нормативы медицинского персонала кабинета врача-аллерголога-иммунолога.

120

Приложение1

Приложение N 3 к Порядку оказания медицинской помощи больным с аллергическими заболеваниями и болезнями, ассоциированными с иммунодефицитами, утвержденному Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 4 февраля 2010 г. N 60н

Стандарт оснащения кабинета врача-аллерголога- иммунолога амбулаторно-поликлинического учреждения, отделения аллергологии и иммунологии, центра аллергологии и иммунологии.

121

Ю.А. Митин

кации персонала лечебно-профилактического учреждения по вопросам диагностики и оказания медицинской помощи в области аллергологии и иммунологии;

•проведение санитарно-просветительной работы с больными;

•оказание консультативной помощи врачам других отделений стационара в вопросах профилактики, диагностики и лечения аллергических заболеваний и иммунодефицитных состояний;

•ведение учетной и отчетной документации, предоставление отчетов о деятельности в установленном порядке, сбор данных для регистров, ведение которых предусмотрено законодательством.

6. Отделение может использоваться в качестве клинической базы образовательных учреждений среднего, высшего и дополнительного профессионального образования, а также научных организаций.

124

Ю.А. Митин

нями, ассоциированными с иммунодефицитами;

•проводит специфическую аллергологическую и иммунологическую диагностику и дифференциальную диагностику с другими заболеваниями;

•проводит иммуномодулирующую терапию больным с подт­ вержденными формами иммунопатологии;

•обеспечивает проведение наблюдения, в том числе диспансерного, за больными, получающими аллергенспецифическую иммунотерапию;

•оказывает консультативную и лечебно-диагностическую помощь при проведении вакцинации иммунокомпрометированных лиц (включая больных тяжелыми формами аллергических заболеваний);

•оценивает состояние иммунного и аллергического статуса взрослого и детского контингентов и проводит мониторинг за их состоянием;

•разрабатывает и проводит мероприятия по выявлению больных с аллергическими заболеваниями и иммунодефицитными состояниями, улучшению и внедрению новых методов диагностики, лечения, диспансеризации и профилактики аллергических заболеваний и иммунодефицитных состояний;

•проводит обучающие программы среди больных с целью профилактики аллергических заболеваний и иммунодефицитных состояний;

•проводит мероприятия по повышению квалификации врачей и среднего медицинского персонала в области аллергологии и клинической иммунологии;

•проводит пропаганду медицинских знаний среди населения

128

Приложение1

по профилактике аллергических заболеваний и иммунодефицитных состояний;

•проводит мониторинг иммунологических нарушений и аллергических заболеваний среди населения;

•ведет учетную и отчетную документацию, предоставляет отчетыодеятельностивустановленномпорядке,осуществляет сбор данных для регистров, ведение которых предусмотрено законодательством;

•участвует в совершенствовании клинических и лабораторных методов диагностики иммунодефицитных состояний и аллергопатологии;

•проводит клинико-эпидемиологический анализ уровня аллергических заболеваний, иммунодефицитных состояний и других форм иммунопатологии;

•осуществляет взаимодействие по проблемам аллергологии и клинической иммунологии с аналогичными учреждениями других регионов;

•осуществляет разработку методических рекомендаций, пособий для врачей и другой научной продукции по проблемам клинической аллергологии и иммунологии;

•осуществляет организацию семинаров, конференций, выставок по проблемам аллергологии и клинической иммунологии.

7. Центрможетиспользоватьсявкачествеклиническойбазы образовательных учреждений среднего, высшего и дополнительного профессионального образования, а также научных организаций.

129

Приложение2

Приложение 2

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛО­ БУЛИНОВ Е В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (АллергоИФА-специфический IgE).

1. Назначение.

1.1.Набор реагентов АллергоИФА-специфический IgE предназначен для количественного определения аллерген-специ- фических иммуноглобулинов Е в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2.Роль антител класса E в возникновении и развитии аллергических реакций известна достаточно давно. Аллергенспецифические иммуноглобулины Е являются промежуточным звеном в цепи передачи сигнала от аллергена к базофилам. Этот сигнал стимулирует выделение базофилами ряда вазоактивных веществ, которые определяют развитие аллергической симптоматики. Выявление и количественное определение концентрации аллергенспецифических IgE имеет большое значение при диагностике и исследовании аллергических заболеваний, для выбора адекватной терапии.

1.3.Набор рассчитан на 96 определений, что, при использовании всех стрипов одновременно, соответствует анализу в дубликатах 6 калибровочных проб, одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ, одной пробы

131

Ю.А. Митин

контрольной сыворотки и в монопликатах анализу 80 неизвестных проб.

Примечание: в случае дробного применения набор может быть использован только в течение месяца после вскрытия компонентов набора.

2. Характеристика набора.

2.1. Принцип действия.

Внаборе АллергоИФА-специфический IgE использован «capture»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта применены два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к IgE, биотинилированные аллергены и конъюгат биотина с пероксидазой хрена. Одно из моноклональных антител иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с эфиром биотина.

Влунках калибровочных проб во время инкубации одновременно происходит иммобилизация молекул IgE, содержащихсявкалибровочнойпробе,натвердойфазеисвязывание их с конъюгатом анти-IgE-биотин. В лунках исследуемых образцов во время инкубации происходит иммобилизация молекул IgE, содержащихся в сыворотке крови, на твердой фазе. Если среди них имеются IgE, специфичные к конкретным аллергенам, то одновременно происходит их связывание с биотинилированным аллергеном. При удалении содержимого из лунок при промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-IgE-биотин и биотинилированных аллергенов, не связавшихся с иммобилизованными в ходе инкубации общими и специфическими IgE соответственно. Во время второй инкубации конъюгат стрептавидин-перок-

132

Приложение2

сидаза связывается с биотинилированными антителами в лунках калибровочных проб и с биотинилированным аллергеном в лунках с исследуемыми образцами сыворотки. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата стрептавидин-пероксидаза.

Во время инкубации с ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного конъюгата стрептавидин-пероксида- за. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочных графиков, построенных с использованием значений оптических плотностей, полученных при длинах волн 450 нм и 405 нм, рассчитывается концентрация специфического IgE в исследуемых образцах. 2.2. Состав набора.

•комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к IgE, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами к IgE» — 1 пакет;

•калибровочные пробы на основе сыворотки крови, аттестованные по Второму международному стандарту

(The 2nd International Referеnce Preparation Human Serum Immunoglobulin E, 75/502), содержащие известные коли-

чества IgE: 0; 0,5; 1; 5; 25 и 100 МЕ/мл; концентрации IgE в калибровочных пробах могут несколько отличаться от указанных величин, точные величины указаны на этикетках флаконов — 6 флаконов (по 0,5 мл);

•контрольнаясыворотканаосновесывороткикровичеловека с известным содержанием общего IgE, маркирована «Контрольная сыворотка» — 1 флакон (0,5 мл);

133

Ю.А. Митин

•конъюгат моноклональных антител с биотином, маркирован «Конъюгат E-1» — 1 флакон (7 мл);

•конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена, маркирован «Конъюгат Е-2» - 1 флакон (18 мл);

•концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер Р» — 2 флакона (14 мл);

•раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ»

— 1 флакон (14 мл);

•стоп-реагент (1 Н соляная кислота), маркирован «Стопреагент» — 1 флакон (14 мл);

•пакет полиэтиленовый закрывающийся (при упаковке стрипов в пакет из 2- слойного полиэтилена) – 1шт.; 2.3. необходимые компоненты, не входящие в состав набора:

•биотинилированные аллергены – лиофилизованные препараты или жидкости (по 3 мл во флаконе). На этикетках флаконов указаны кодовые номера и названия аллергенов. Содержимого одного флакона достаточно для 26-ти определений.

3. Аналитические и диагностические характеристики набора:

3.1.Специфичность. Не обнаружено перекрестной реакции моноклональных антител к IgЕ с IgA, IgG, IgM и IgD.

3.2.Коэффициент вариации результатов определения аллергенспецифических иммуноглобулинов Е в одном и том же образце сыворотки крови с использованием набора АллергоИФА-специфический IgЕ не превышает 8%.

3.3.Линейность. Зависимость концентрации аллергенспецифических иммуноглобулинов Е в образцах сыворотки крови при разведении их сывороткой крови, не содержащей IgE, имеет линейный характер в диапазоне концентраций

134

Приложение2

0,5–100 МЕ/мл и составляет +10%.

3.4.Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» общего IgE — соответствие измеренной концентрации общего IgE предписанной в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы 1 МЕ/мл. Процент открытия составляет 90–110%.

3.5.Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация иммуноглобулинов Е в сыворотке крови человека не превышает 0,15 МЕ/мл.

4. Меры предосторожности.

4.1.Потенциальный риск применения набора — класс 1.

4.2.Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

4.3.При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарноэпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва,1981 г.).

4.4.Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

4.5.При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать

135

Ю.А. Митин

ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций.

4.6.Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

4.7.Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

5. Оборудование и материалы.

•Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках при длинах волн 450 нм, 405 нм и 620 нм (референтная длина волны). Применение длины волны 620 нм не является обязательным, но предпочтительнее, поскольку позволяет обнаружить интерференцию пластика;

•прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание c амплитудой колебаний 3–4 мм и частотой 8–13 Гц (500–800 об/мин) при температуре +37°С;

•пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изменяемым объемом отбора жидкостей: на

5–50 мкл; на 40–200 мкл; на 200–1000 мкл; на 1000–5000 мкл;

•пипетка полуавтоматическая восьмиканальная со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл;

•цилиндр мерный, позволяющий отмерять 500 мл;

•вода дистиллированная;

•бумага фильтровальная;

•стаканы стеклянные;

136

Приложение2

•перчатки резиновые или пластиковые.

6. Анализируемые образцы.

6.1.Забор крови из вены осуществляют с соблюдением правил асептики. После формирования сгустка сыворотку отделяют путем центрифугирования. Для проведения анализа не разрешается использовать плазму крови, гемолизированную или мутную сыворотку, а также образцы сыворотки, содержащие азид натрия.

6.2.Образцы сыворотки крови разрешается хранить при температуре +2…8°C не более 2 суток; при необходимости более длительного хранения рекомендуется аликвотировать образец и хранить в замороженном виде при температуре -20°C или ниже. Не допускается повторное замораживание образца.

7. Проведение анализа.

7.1.Перед началом работы выдерживают все компоненты набора при комнатной температуре (+18…25°С) в течение времени не менее 30 минут. Все жидкие реагенты и контрольные образцы перед использованием тщательно перемешивают.

7.2.Калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.

7.3.Стрипы. Перед вскрытием пакет со стрипами необходимо выдержать при комнатной температуре (+18…25°С) в течение времени не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов.

7.4.Конъюгат Е-1 готов к использованию.

7.5.Конъюгат Е-2 готов к использованию.

7.6.Промывочный буфер. Необходимое количество Буфера Р развести дистиллированной водой в 20 раз.

137

Ю.А. Митин

Например:5 мл Буфера Р + 95 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать, избегая пенообразования.

7.7.Раствортетраметилбензидина(ТМБ)готовкиспользованию.

7.8.Стоп-реагент готов к использованию.

7.9.Растворы аллергенов. Жидкие аллергены готовы к использованию. Восстановление лиофилизованных аллергенов. Перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к пробкам. Открыть флаконы и положить пробки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с аллергеном внести по 3,0 мл дистиллированной воды и закрыть пробки. Выдержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре (+18…25°С). Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая пенообразования. В течение следующих 10 минут выдержать флаконы при комнатной температуре, перио­ дически перемешивая.

7.10.Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом:

А1, А2 – № 1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ; В1, В2 – № 2 для измерения величины оптической плот-

ности калибровочной пробы 0 МЕ/мл; С1, С2 – № 3 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 0,5 МЕ/мл;

D1, D2 – № 4 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 1 МЕ/мл; Е1, Е2 – № 5 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 5 МЕ/мл;

F1, F2 – № 6 для измерения величины оптической плот-

138

Приложение2

ности калибровочной пробы 25 МЕ/мл;

G1, G2 – № 7 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 100 МЕ/мл; Н1, Н2 – № 8 для измерения величины оптической плотности контрольной сыворотки.

Внести в соответствующие лунки по 50 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 50 мкл исследуемой сыворотки крови.

Схема проведения анализа.