2 курс / Биохимия / Кленова_Биохимия_патологических_состояний

дикальных процессов в клетке. Поддержание оптимального функционирования митохондрий в условиях пониженного парциального давления кислорода может выступать одним из ведущих средств коррекции энергообеспечения клеток [23]. Согласно выдвинутой в 1985 году гипотезе о ней- ротрансмиттерно-субстратнонуклеотидных системах существуют прямые связи между рецепторным аппаратом и энергетическим обменом в клетках [6]. На уровне клеток работают две противоположно направленные системы: катехоламины – янтарная кислота – цАМФ – АТФ; ацетилхолин – α-кетоглутарат – цГМФ – ГТФ. Катехоламины усиливают образование и окисление сукцината, который аллостерически активирует сукцинатдегидрогеназу и моноаминоксидазу. Ацетилхолин наряду с торможением окисления сукцината активирует окисление α-кетоглутарата, проявляющего холиномиметический эффект. Последний связан с ингибированием ацетилхолинэстеразной активности при одновременном повышении содержания ацетилхолина в крови и тканях [6]. Указанная реципрокность обеспечивает клеткам возможность направленной регуляции эффективности митохондриального окислительного фосфорилирования в зависимости от энергетических и пластических потребностей клетки, а также коррекции гипоксического состояния [12].

Свободнорадикальные процессы. Окислительный стресс

Смещение баланса в сторону избыточной генерации свободных радикалов при дефиците антиоксидантов принято называть окислительным стрессом, который сопровождает гипоксические повреждения. Окисли-

тельный стресс и повреждение мембран. Кроме биохимических (высоко-

интегрированных, в несколькими уровнями регуляции) реакций, в клетках могут протекать и химические процессы. В основном источником химических превращений в клетках служат высокоагрессивные, реакционноспособные соединения, среди которых есть продукты метаболизма: мочевина, различные альдегиды, спирты, кетоны; промежуточные амфиболиты: аскорбиновая кислота, глутатион, токоферолы, гидрохиноны, филохиноны; основные метаболиты: глюкоза, фруктоза и их производные. Реакции, протекающие в клетках чисто химическим путем (без участия ферментов), получили название изнанки метаболизма и будут рассмотрены позже, в отдельном разделе. Весьма агрессивными в химическом отношении соединениями являются активные кислородные метаболиты (АКМ). Известно, что реакция восстановления кислорода до воды лежит в основе энергетики кислороддышащих организмов. Однако, наряду с сопряженным с дыханием окислительным фосфорилированием, в которое вовлекается 90% потребляемого кислорода, в клетках постоянно протекают реакции с образованием АКМ: супероксидного радикала (О2-), перекиси водорода (Н2О2), гидроксильного (НО•), хлоридного (НОCL•) и перекисного радикалов (RO2•).

161

Кислород в своем основном состоянии – бирадикал, два неспаренных электрона которого с параллельными спинами располагаются на разрыхляющих молекулярных π-орбиталях. Это делает его относительно инертной молекулой. Вместе с тем кислород активно взаимодействует с органическими радикалами, имеющими неспаренный электрон. Данная реакция имеет важное значение в живых организмах, запуская цепные процессы свободнорадикального окисления липидов, являющихся легко окисляемыми соединениями. Радикальные процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) протекают во всех клетках живых организмов, главным образом, в фосфолипидных структурах мембран.

В основе современного представления о механизмах ПОЛ лежит выдвинутая в 1887 году гипотеза А.Н.Баха о возможности непосредственного присоединения молекулярного кислорода к органическим молекулам с образованием гидроперекисей. Субстратом окисления в биологических системах являются, в первую очередь, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), входящие в состав триглицеридов и фосфолипидов. Как все цепные реакции, процессы ПОЛ делят на три фазы: зарождение цепей, развитие цепных реакций и обрыв цепей. Зарождение цепей начинается в результате образования свободного радикала окисляющегося соединения. Источником могут стать радикалы, образующиеся под действием ионизирующих излучений, УФ-излучений, озона, свободных радикалов дыма табака, свободных радикалов химических реакций, АМК и других воздействий. Первая фаза является узким местом всей цепной реакции, и от ее скорости зависит скорость всего ПОЛ. На следующей стадии свободные радикалы быстро взаимодействуют с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате такого взаимодействия образуется перекисный радикал RO2•. Очень важно, что в молекулах гидроперекисей линолевой, линоленовой и арахидоновой кислот может формироваться система сопряженных двойных связей. Последовательность реакций в случае линоленовой кислоты:

―СН2―СН═ СН―СН2―СН═ СН―СН2―

8 9 10 11 12 13 14

―СН2―СН― СН―СН2―СН― СН―СН2―

│ │ │ │

+ О2

―СН2―СН― СН═ СН―СН═ СН―СН2―

│

О―О―

162

Молекулы с двумя сопряженными двойными связями могут быть обнаружены спектрофотометрически с max поглощения λ233 нм. Они получили название диеновых конъюгатов и служат чувствительным тестом на обнаружение гидроперекисей ПНЖК. Поскольку диеновые конъюгаты появляются в сущности на стадии образования свободных радикалов (СР), то увеличение их количества говорит о ускорении их возникновения. Так как конъюгация может произойти примерно у 50% СР, образовавшихся из ПНЖК, теоретически отношение числа гидроперекисей к числу диеновых коньюгатов равно 2, что подтверждается и экспериментальными данными. Большая часть липидных гидроперекисей в биологических мембранах образуется из ПНЖК, находящихся в β-положении мембранных фосфолипидов. В качестве наиболее окисляемых жирнокислотных остатков выступают арахидоновая, линолевая и деказогексаеновая кислоты, расположенные в β-положении фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и фосфатидилхолина (ФХ). Появление диеновых кетонов обусловлено реакцией дегидрирования гидроперекисей, количество диеновых кетонов можно зарегистрировать при

λ273 нм [13].

Возникающие в результате окисления органические перекиси могут включаться в процесс генерации радикалов в присутствии металлов переменной валентности, так как в этом случае наблюдается их разложение с образованием реакционного алкоксильного радикала:

Самой распространенной из подобных реакций является реакция Фентона, так как в клетках больше всего двухвалентного железа:

Двухвалентное железо в составе гемовых структур способно прочно связываться липидами биомембран, становясь центром радикалообразования. Кроме того, ионы железа участвуют еще в двух реакциях, приводящих к формированию радикалов:

163

Обрыв цепных реакций ПОЛ возможен также при взаимодействии с антиоксидантами: глутатионом, аскорбиновой кислотой, токоферолами, убихиноном, мочевой кислотой, билирубином и др. Тормозят свободнорадикальное окисление (СРО) и специальные ферментативные системы антирадикальной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза).

ПОЛ как часть СРО имеет важное значение, так как служит сигналом к обновлению фосфолипидного бислоя мембран. Поэтому системы антиоксидазной защиты (АОЗ) направлены на поддержание ПОЛ на стационарном уровне. Недостаток антиоксидантов, действие внешних прооксидантов, а также активация эндогенного производства АКМ приводят к напряжению механизмов АОЗ и развитию окислительного стресса, который имеет проявления на клеточном, тканевом и организменном уровнях.

Производство АКМ в ферментативных реакциях. Активация кисло-

рода в биологических системах происходит прежде всего в оксидазных реакциях. В состав ферментов оксидаз входят металлы переменной валентности. В 1978 году был составлен первый каталог оксидаз, в который вошло 220 ферментов [9]. Все они представляют собой металлсодержащие протеиды, в состав функциональных доменов которых входят железо, медь, цинк, молибден, марганец, кобальт. По строению активного центра их делят на пять основных классов.

(1)Определяющее состояние кислорода – О2. Сюда относятся гемопротеиды, не являющиеся ферментами: гемоглобин, миоглобин, гемоэритрин, гемоцианин. Окисления металла при выполнении функции обычно не происходит.

(2)Определяющее состояние кислорода – О2- (ксантиноксидаза. НАДФН-оксидаза). Реакция окисления субстрата происходит по схеме: ХН2 + О2 → Х + О2- + 2Н+.

(3)Преобладающее состояние кислорода – О22- (аминоксидазы, ката-

лаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза). Осуществляют перенос двух электронов на кислород: ХН2 + О2 → Х + Н2О2.

(4)Перенос четырех электронов, разрыв связи –О-О- и образование двух молекул воды (цитохромоксидаза; аскорбатоксидаза):

2ХН2 + + О2 → 2Х + 2Н2О.

(5)Преобладающее состояние кислорода – О23-, что также приводит к разрыву –О-О- связи и образованию воды, а также О•, который обычно встраивается в субстрат окисления по схеме:

Х + О2 + АН2 → ХО + Н2О + А (циклооксигеназа, липоксигеназа и цитохромы Р-450) [9].

Таким образом, все оксидазы (включая неферментативные гемопротеиды, транспортирующие кислород) в определенных условиях способны генерировать АКМ, которые могут утилизироваться системами АОЗ или обусловливать неферментативное ПОЛ. Часть же оксигеназ, суб-

164

стратами которых служат жирные кислоты, активируют как ферментативное, так и неферментативное ПОЛ. Циклооксигеназа окисляет жирные кислоты до циклических эндоперекисей, запускающих производство как свободных радикалов неферментативным путем, так и образование простагландинов, простациклинов, тромбоксанов в соответствующих ферментных комплексах. Цитохромы Р-450 гидроксилируют и эпоксилируют жирные кислоты и различные ксенобиотики, липоксигеназы окисляют жирные кислоты по двойным связям, внося перекисный радикал, превращая их в лейкотриены. Активация производства АКМ лежит в основе не только процессов обновления фосфолипидного бислоя мембран, но и апоптозной и некрозной гибели клеток, защитной функции нейтрофилов [10].

Характеристика основных форм активных кислородных метаболитов

(1) Супероксидный анион-радикал О2-. Супероксидный радикал более реакционноспособен, чем О2, характеризуется наличием неспаренного электрона, в водных растворах присоединяет протон и переходит в форму НО2•, являющуюся слабой кислотой. Время жизни в биологических субстратах – 10-6с. В виде супероксида имеет заряд и плохо проходит через мембрану, служит слабым окислителем, может стать и донором электронов, восстанавливая ряд соединений. Супероксидный анион является промежуточным продуктом во многих биохимических реакциях: окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, в метаболизме ксенобиотиков. Основные источники: ферментативные системы НАДФНоксидаз, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальная система монооксигеназ.

Рассмотрим некоторые ферментативные системы производства супер-

оксида и их функции. Миелопероксидазная система нейтрофилов. Дан-

ная система представляет собой НАДФН-оксидазный ферментативный комплекс, восстанавливающий кислород до супероксида. Комплекс мембраносвязан, состоит по меньшей мере из трех компонентов: ФАДпротеид; цитохром-в558 и убихинона. При активации НАДФН-оксидазы происходит самосборка ферментативного комплекса, осуществляющего перенос электронов с цитозольного НАДФН на О2:

НАДФН → ФАД-Е → убихинон → Цитохром-в558 → О2 →

О2-• + О2-• → Н2О2 → + Cl- (Br-; I-; SCN-) → НОСl; HOBr; HOI; HOSCN CОД МПО

СОД – супероксиддисмутаза; МПО – миелопероксидаза.

Таким образом, генерация супероксид-аниона является пусковым механизмом образования Н2О2 и других реакционноспособных цитотоксических радикалов. Фагоцитирующие клетки, обладающие низкой активно-

165

стью НАДФН-оксидазы, проявляют слабую бактерицидную способность. Кроме того, супероксидный радикал участвует в реакции Фентона, восстановление трехвалентного железа в двухвалентное ведет к генерации ОНрадикала, очень реакционно агрессивного. Ксантиноксидаза представляет собой интересный фермент, участвующий в механизмах регуляции многих процессов жизнедеятельности клетки. В нормальных условиях находится преимущественно в дегидрогеназной форме и может обратимо или необратимо переходить в оксидазную, что наблюдается, в частности, при ишемии или гипоксии. Необратимая активация ксантиноксидазы – пусковой механизм направления клетки на апоптозную гибель.

Супероксидный радикал генерируется также в митохондриях при транспорте электронов по дыхательной цепи ферментов. В частности, генерация осуществляется в ходе окисления↔восстановления убихинона (Q :

QH2 + O2 → QH• + H+ + O2-•;

QH• + O2-• → Q + H+ + O2-•.

В восстановленном состоянии убихинон является антиоксидантом, нейтрализуя супероксидный анион:

2 O2-• + QH2 → H2O2 + O2 + Q + 2 ē.

Для регуляции уровня генерации супероксидного радикала служит супероксиддисмутаза (СОД), фермент антиоксидантной защиты. Молекулярная масса СОД – 31 тыс. Да. Существует несколько изоферментных форм СОД: медь-, цинк-; марганец-; железосодержащие супероксиддисмутазы. Медь- и цинксодержащие СОД локализованы в цитоплазме и межмембранном пространстве митохондрий у эукариотов, чувствительны к цианиду. Марганецсодержащая СОД – цианрезистентна, локализована в матриксе митохондрий и встречается у бактерий, хотя для них более характерна железосодержащая СОД. Экзоцеллюлярная СОД существует в виде профермента с молекулярной массой около 150 тыс. Да. СОД осуществляет реакцию:

O2-• + O2-• + 2 Н+ → Н2О2 + О2 и инактивируется избытком перекиси водорода.

(2)Перекись водорода относится к окислителям средней силы. В отсутствие каталазы, глутатионпероксидазы или ионов металлов Н2О2 относительно стабильна и может мигрировать из клетки в межклеточное пространство и проникать в другие клетки. Источники перекиси водорода – оксидазы, переносящие 2 ē на молекулу кислорода: аминоксидазы, иногда ксантиноксидаза и супероксиддисмутаза. Около 80% перекиси водорода, генерируемой фагоцитами в очаге воспаления, образуется в супероксиддисмутазной реакции. Перекись водорода служит источником ОНрадикала, взаимодействуя с двухвалентным железом или другими метал-

166

лами переменной валентности. А также она является субстратом миелопероксидазы для образования высокореакционных гипогалоидов. Генерация перекиси водорода приводит к закислению среды в очаге воспаления и обусловливает гибель многих бактериальных клеток. Большинство эукариотических клеток устойчивы к перекиси водорода за счет присутствия разлагающих ее ферментов: каталазы; глутатионпероксидазы (ГПО); причем ГПО эффективно работает при малых концентрациях Н2О2 (высокая Кm), каталаза – при более высоких (низкая Km). Каталаза локализована в пероксисомах, а ГПО – в цитозоле и митохондриях. Они катализируют следующие реакции:

2Н2О2 → 2Н2О + О2

каталаза

2GSH + Н2О2→ GSSG + 2H2O

глутатионпероксидаза.

Глутатион (GSH) способен также взаимодействовать с другими перекисными соединениями, эффективно тормозя ПОЛ:

2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O.

Гипогалоиды образуются при реакции перекиси водорода с галидами, катализируемой миелопероксидазой (МПО) нейтрофилов и пероксидазой эозинофилов. Ферменты отличаются по структуре и субстратной специфичности. Основным продуктом МПО является ОНСl-, пероксидазы эозинофилов – ОНBr-. Миелопероксидаза локализуется в гранулах нейтрофилов. Дегрануляция приводит к освобождению МПО и образованию гипогалоидов. Применение к продуктам миелопероксидазной реакции термина «активные формы кислорода» не совсем верно, так как это по сути активные формы галогенов, но активными кислородными метаболитами их называть можно. Гипогалоиды ингибируют α1-антитрипсин (ингибитор сериновых протеаз), что приводит к активации протеолиза. Также они активируют коллагеназу, что обусловливает разрушение экстрацеллюларного матрикса в местах воспаления, окисляют лейкотриены, иммуноглобулины, альбумин, могут индуцировать ПОЛ. При взаимодействии с белками окисляют сульфгидрильные группы, но все же их главный эффект связан с нейтрализацией ингибиторов протеингидролаз.

Гидроксильный радикал (ОН•). Наиболее реакционноспособен из всех АКМ. Может разрывать любую С-Н и С-С связь. Образование этого радикала идет в реакции Габера-Вейса:

О2-• + Н2О2 → ОН- + ОН• + О2.

167

В реакциях окисления арахидоновой кислоты, при макросомальном окислении жирных кислот также генерируется ОН-радикал. Однако основной источник этого агрессивного радикала – реакция Фентона:

Обратное восстановление Fe3+ возможно при взаимодействии с супероксидным радикалом: Fe3+ + О2-• → Fe2+ + О2, а также при реакциях с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином.

Цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений на живые организмы напрямую связано с генерацией ОН-радикала

впроцессе радиолиза воды: Н2О → ОН• + Н+ + ē. Радикалы ОН• участвуют

вмикробицидном и цитотоксическом действии гранулоцитов, моноцитов, Т-лимфоцитов. Генерация ОН-радикалов существенно лимитируется наличием ионов железа. Данные радикалы повреждают многие клеточные структуры, индуцируют образование органических радикалов и запускают процессы ПОЛ. Специфических ферментов, превращающих ОН-радикалы, подобных СОД, нет. Защиту осуществляют в некоторой степени низкомолекулярные соединения: урацил, мочевая кислота, глюкоза, диметилсульфоксид и др.

Синглетное состояние кислорода. Основное состояние молекулярно-

го кислорода – триплетное. Изменение спина одного из электронов, находящихся на π-орбиталях в молекуле кислорода, приводит к образованию возбужденного синглетного состояния, энергия которого на 96,3 кДж/моль больше, чем энергия триплетного. Высокая реакционная способность синглетного кислорода ведет к тому, что он легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями, инициируя ПОЛ [9].

ПОЛ и его продукты в эволюционном плане представляют один из наиболее ранних регуляторных механизмов и выступают в роли первичного медиатора стрессовой ситуации. Образование АКМ – неотъемлемое звено существования высших форм живых организмов. Они принимают активное участие в деструкции тканей в ходе воспалительного процесса, образуются в результате активации фагоцитов, регулируют пролиферацию и гибель клеток, участвуют в поддержании тонуса сосудов. Производство АКМ служит главным регулятором процессов обмена, апоптоза клеток и организма, играет значительную роль в эволюционном процессе.

В1967 г. Р.Х. Мак Артур и Е.О. Уилсон выдвинули гипотезу о существовании в популяциях стратегий жизни двух типов: тип R предполагает бурное размножение и короткую продолжительность жизни; тип К – низкие темпы размножения и долгую жизнь. К-стратегия характерна для благоденствия популяции в уже захваченном ареале и в относительно стабильных условиях среды. Эволюционный процесс в такой популяции идет медленно. Изменение условий среды приводит к переключению на страте-

168

гию R, что сопровождается ускорением темпов размножения и жизни, сокращению продолжительности жизни. Что же лежит в основе выбора стратегии, каков механизм восприятия изменений условий жизни? В 1998 году Э.Мур получил трансгенное растение табака с повышенной экспрессией одного из генов, кодирующего шаперон mHsp70. Трансгенный табак был вдвое выше нормального, втрое увеличилось количество митохондрий в клетках и скорость процессов дыхания. Оказалось, что резкое повышение производства mHsp70 ускоряло импорт и фолдинг митохондриальных белков, ответственных за дыхание и фосфорилирование. Усиление дыхания и синтеза АТФ и стимулировало рост растения. Таким образом, суперпродукция mHsp70 может быть молекулярным механизмом переключения стратегий. Ухудшение условий среды существования организма приводит к усилению экспрессии mHsp70, активирует дыхательный процесс, что увеличивает производство АКМ. Повышенный выход АКМ способствует активации мутационного процесса, появлению большего генетического разнообразия и формированию приспособлений к изменившимся условиям среды. Однако ускорение производства АКМ способствует и более быстрому старению и гибели клеток и уменьшению продолжительности жизни организма [24].

Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз клеток

В организме в качестве физиологических индукторов апоптоза выступают цитокины и стероидные гормоны. Одна из главных причин развития окислительного стресса под действием стероидных гормонов – снижение уровня производства ферментов-антиоксидантов: каталазы, супероксиддисмутазы, а также уменьшение концентрации восстановленного глутатиона. К цитокинам – индукторам апоптоза – относят факторы некроза опухолей (ФНО) и интерлейкин 1β (ИЛ-1β). Интерлейкин1β в комбинации с интерфероном γ, ФНО активирует синтез NO-синтезы (NOS) и продукцию NO-радикалов. Эндогенные и экзогенные NOрадикалы индуцируют гибель макрофагов, β-клеток поджелудочной железы, гладкомышечных клеток, опухолевых клеток. В основе повреждающего действия радикала окиси азота лежит образование сильного окислителя – пероксинитрита:

O2-• + NO• → ONOO-.

Пероксинитрит способен окислять аминогруппы и тиоловые группы белков, индуцировать процессы переокисления липидов в мембранах, способствует образованию ОН-радикалов [10]:

2ONOO- + 2 H+ → ONOOH → OH• + NO2.

169

В присутствии пероксинитрита или продуктов его распада образуются радикалы глутатиона и инициируется ПОЛ. В то же время есть основания рассматривать процесс генерации окиси азота в нитратсинтазной системе клеток как фактор адаптационной защиты при гипоксических состояниях. Н.Н. Кургалюк и соавторы [14] показали, что особенности развития биоэнергетической гипоксии у животных с разной резистентностью к кислородной недостаточности определяются NO-зависимыми эффектами. Среди них NO-зависимое снижение интенсивности окисления, вызванное активацией холинергических мускариновых M2- и брадикиновых ВК2- рецепторов в скелетных мышцах.

Оксид азота выполняет роль и вторичного посредника, синтезируемого в клетках из L-аргинина под влиянием нитратсинтазы (NOS). Эффекты окиси азота реализуются через активацию растворимой гуанилатциклазы и синтеза другого вторичного посредника – цГМФ, что сопровождается блокированием фосфолипаз и входа кальция в клетку. Этим объясняются стресс-лимитирующие эффекты NO. Установление роли ацетилхолина как эндогенного вазоактивного регулятора, стимулирующего продукцию NO, показывает стратегию адаптационных изменений в условиях гипоксии. Основной физиологический эффект ацетилхолина состоит в экономизации поглощения кислорода и его использования тканями за счет переключения на «быстрый» цикл Кребса (повышение роли аминотрансферазных реакций) при стрессах и гипоксии. С установлением локализации NO-синтазы на внутренней мембране митохондрий были описаны прямые эффекты влияния окиси азота на функционирование дыхательной цепи. Прямое измерение продукции NO в интактных митохондриях подтвердило высказанную раньше гипотезу, что оксид азота, продуцируемый митохондриями, изменяет показатели дыхания и синтеза АТФ через ингибирование цитохромоксидазы (ЦО). Цитохромоксидаза осуществляет превращение оксида азота в нитрит- и нитратанионы. В настоящее время большое внимание привлекает возможная роль окиси азота как регулятора процессов дыхания в связи с тем, что митохондриальная нитратсинтаза располагается вблизи ЦО. Показано, что в условиях острой гипоксии активность ЦО повышается, она сохраняет способность к транспорту электронов на кислород даже при тяжелой гипоксии [16], когда выключается НАД-зависимое окисление субстратов и тормозится окисление на участке от цитохрома b к цитохрому с1. Ингибирование ЦО в этих условиях активирует цикл окиси азота. На роль сенсорных элементов, определяющих степень гипоксического влияния могут претендовать и другие гемсодержащие белки: гемоглобин, миоглобин, цитохром Р-450, переводя клетки на режим нитрат- но-нитритного дыхания в условиях дефицита кислорода [16].

Ускорение производства АКМ в условиях перехода от гипоксии к реоксигенации, инициация ПОЛ, разрушение мембран ведет к освобождению

170