2 курс / Биохимия / Биохимические_и_генетические_особенности_реализации

102

Рисунок 13. Аннотация контигов изолятов S.haemolyticus, содержащих гены токсинов и гены профагов: а – контиг

9 изолята SH421; b – контиг 4 изолята SH527

106

Наиболее активно образовывал биопленки изолят S.haemolyticus SH527.

Оптическая плотность образца, покрашенной кристаллическим фиолетовым,

биопленки изолята SH527 превышала оптическую плотность среды культивирования, используемой в качестве отрицательного контроля в 7,8

раза через сутки и в 7 раз через двое суток. Что касается изолятов

S.epidermidis (SE36-1, SE41, SE528),то значение оптической плотности для соответствующих им образцов было ниже, чем для изолята S.haemolyticus

SH527, но сопоставимо со значениями для других изолятов S.haemolyticus

(SH39, SH421 и SH864-1). Наибольшее значение оптической плотности было характерно для изолята SE36-1 и составило 1,154 через сутки и 0,842 через 24

часа, что превышает оптическую плотность отрицательного контроля в 4 раза через сутки и в 3,4 раза через 24 часа.

Таким образом, на основании данных, полученных методом оценки способности формирования биопленок с помощью окраски раствором кристаллического фиолетового были отобраны изоляты S. epidermidis SE36-1

и S. haemolyticus SH527 с целью дальнейшего изучения особенностей формирования биопленок на основании данных сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Кроме того для сравнения был взят лабораторный штамм коагулазоположительного вида S. aureus АТСС 29213. Способность к формированию биопленок штаммом S. aureus АТСС 29213 была обусловлена детекцией генов ica оперона, ответственных за продукцию полисахаридов биопленки.

Результаты СЭМ показали, что после первых 24 часов культивирования в триптонсоевом бульоне бактерии S. aureus АТСС 29213 не образовывали биопленок (рис. 15 А). Участки образования ЭПС матрикса, покрывающего часть бактерий, зарегистрированы только после 48 часов культивирования

(рис. 15 В). Бактерии S. epidermidis SE36-1 уже через 24 часа параллельно с процессом адгезии начинали формирование биопленки (рис. 15 C). Через 48

часов инкубации было отмечено формирование бактериями микроколоний, а

108

Для визуализации взаимодействия стафилококков с культурой клеток человека, бактериальные клетки инкубировали совместно с монослоем клеток HT-29, после чего были подготовлены препараты для СЭМ. В

контрольном препарате к клеткам НТ-29 добавлена среда для культивирования стафилококков. По результатам СЭМ в контрольном препарате клеточная культура HT-29 была представлена монослоем клеток с бугристой поверхностью, отростками и выступающими округлыми ядрами.

Пространство между клетками было заполнено гомогенным веществом

(межклеточным матриксом), с глобулярными и фибриллярными включениями. Клетки контактировали между собой посредством отростков

(рис. 16).

Рисунок 16. Сканограмма препарата клеточной культуры HT-29 после 24

часов инкубации со средой культивирования стафилококков (контроль),

увеличение Х 1000.

При инкубации клеток человека с клетками S. aureus ATCC29213 в

первые часы инкубации (1 и 2 часа) наблюдалась адгезия бактерий на поверхности клеток НТ-29, при этом большинство бактерий располагались в межклеточном пространстве (рис. 17 A, B). Через 3 часа наблюдали колонизацию бактериальными клетками поверхности НТ-29, а также была

110

Рисунок 17. Сканограмма препаратов, отражающих взаимодействие S. aureus АТСС29213 с культурой клеток человека НТ-29: А - срок инкубации 1 час, увеличение Х 4000, В - срок инкубации 2 часа,

увеличение Х 4000 , С - срок инкубации 3 часа, увеличение Х 1000 , D -

срок инкубации 3 часа, увеличение Х 4000, E - срок инкубации 24 часа,

увеличение Х 1000 , F - срок инкубации 24 часа, увеличение Х 4000, G -

срок инкубации 48 часов, увеличение Х 1000 , H - срок инкубации 48

часов, увеличение Х 4000

Взаимодействие S. epidermidis SE36-1 с клетками НТ-29 на ранних этапах инкубации (1 и 2 часа) не отличалось по своему характеру от взаимодействия S. aureus ATCC29213 с клетками НТ-29 (рис. 18 А, В). Через

3 часа совместной инкубации с клетками S.epidermidis SE36-1 происходила деформация клеточного пласта, но, в отличие от взаимодействия с клетками НТ-29 S. aureus ATCC29213, изменения в архитектонике клеточного пласта носили ограниченный характер (рис. 18 C, D).Через 24 часа инкубации количество бактерий резко увеличивалось. Деформация клеточного пласта была более отчетливой, чем на сроке инкубации 3 часа (рис. 18 E, F). Через

48 часов инкубации деформация клеточного пласта была максимальна,

наблюдалась массовая деструкция клеток НТ-29, были выявлены остатки клеточного скелета («остов» клеток) (рис. 18 G, H, I).