Методы мол-ген иссл

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России

Кафедра биологии с курсом медицинской генетики

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ВСЕХ ФАКУЛЬТЕТОВ МЕДИЦИНСКОГО ВУЗА

Краснодар

2023

2

УДК 616-07:001.89 ББК 51.1(2)2

М 54

Составители: сотрудники кафедры биологии с курсом медицинской генетики ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России И.И. Павлюченко, заведующий кафедрой, д.м.н., профессор; К.Ю. Лазарев, доцент кафедры, к.м.н., доцент; Д.В. Рукавичкин, ассистент кафедры, к.м.н; А.А. Тодуа, клинический ординатор кафедры.

Рецензенты:

Н. В. Колесникова, профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России профессор д.б.н.

Е. Е. Есауленко, профессор кафедры фундаментальной и клинической биохимии ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России доцент д.б.н.

Методы молекулярно-генетических исследований : методические указания для студентов всех факультетов медицинского ВУЗа. / ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России; составители: И. И. Павлюченко, К. Ю. Лазарев, Д. В. Рукавичкин, А. А. Тодуа, - Краснодар, - 38 с. - Текст : электронный.

Методические указания разработаны в соответствии с:

•Федеральным государственным образовательным стандартом высшего образования, утвержденным приказом Министерства образования и науки Российской Федерации от 12 августа 2020 г. N 988 «Об утверждении федерального государственного образовательного стандарта высшего образования - специалитет по специальности 31.05.01 Лечебное дело» (с изменениями и дополнениями) Редакция с изменениями N 1456 от 26.11.2020;

•Рабочей программой дисциплины «Генетические технологии в медицине»

(2023).

Рекомендовано ЦМС ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России от 14 декабря 2023г., протокол №11.

УДК 616-07:001.89 ББК 51.1(2)2

М 54

Павлюченко И.И., Лазарев К.Ю., Рукавичкин Д.В., Тодуа А.А.

2.Выделение нуклеиновых кислот ..…...……………….……...…………...7

Сравнение основных методов выделения нуклеиновых кислот………..…..9

Экспресс-методы……………………………………………………………...11 Сорбентные методы……………………...…………………………………...11

Спиртовое осаждение (преципитация)……………………………………...12 Фенольно-хлороформный метод ………………………………...………….13

Спин-колонки…………………………………………………………………14 Метод стеклянных бусин…………………………………………………….15

3.Полимеразно-цепная реакция………………………..…………………..16

Рекомендуемая Основная…………………………………………………..……..…………... 36 Дополнительная………………………………………..……...……………... 36

Литература, использованная составителями ………………….……………... 36

4

ПРЕДИСЛОВИЕ

Цель методических указаний – помощь студентам всех факультетов медицинского ВУЗа в овладении компетенциями: иметь представления о методиках проведения молекулярно-генетического исследования и способности проводить обследование пациента с целью установления диагноза на основе интерпретации результатов генотипирования (ПК-2).

Методические указания включают предисловие, введение, основную часть (организация работы в лаборатории, выделение нуклеиновых кислот, приготовление реакционных смесей, механизм полимеразной цепной реакции, амплификация в режиме реального времени, классическая амплификация с последующей электрофоретической детекцией, секвенирование), практическое использование ПЦР-диагностики, тестовые вопросы для контроля усвоения знаний и литературу. Каждый раздел основной части описывает алгоритм работы на определенном этапе молекулярно-генетического исследования.

Методические указания рекомендованы студентам ВУЗов, получающих медицинские и фармацевтические специальности.

5

ВВЕДЕНИЕ

Развитие молекулярно-генетических методов и внедрение их в научную и практическую медицину существенно расширяет возможности ученых и врачей в выявлении мутаций моногенных синдромов, типировании генов предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям, диагностике инфекционных заболеваний, определении видовой принадлежности микро- и макроорганизмов, идентификации личности и биологического родства в су- дебно-медицинских исследованиях, изучении механизмов внутриклеточной сигнализации, создании новых биомаркеров.

Полимеразная цепная реакция - это метод, имитирующий естественную редупликацию ДНК, и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.

Внастоящее время широко внедряются новые молекулярногенетические технологии - количественного определения ДНК/РНК - ПЦР в реальном времени, секвенирование ДНК на автоматическом генетическом анализаторе. Результаты исследований позволяют прогнозировать генетические риски, проводить первичную и вторичную профилактику наследственных болезней, ориентироваться в выборе наиболее эффективного лекарственного средства для конкретного пациента, оценивать эффективность проводимой терапии, проводить биологическую идентификацию личности. Медицинское сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностики и начала лечения болезни на доклинической стадии.

Вфункционирующей на базе кафедры биологии с курсом медицинской генетики КубГМУ современной лаборатории молекулярно-генетических исследований существует возможность проведения исследований не только сотрудниками ВУЗа, но и студентами. Начинающие работать в молекулярногенетической лаборатории сталкиваются с рядом вопросов методического характера. Многочисленные литературные источники отражают отдельные аспекты методологии проведения исследования. Данные методические рекомендации восполняют этот недостаток; составлены на основании современных методик и нормативно-правовых документов по ПЦР, используемых при проведении ДНК-исследований.

1. ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ В ЛАБОРАТОРИИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологических требований по профилактике инфекционных болезней» (2022г.) в молеку- лярно-генетической лаборатории должны быть выделены территориальноавтономные операционные зоны, каждая из которых предназначена для выполнения строго определенного круга операций. Каждая зона должна быть укомплектована спецодеждой, лабораторным и офисным оборудованием, лабораторной посудой, которые предназначены для использования только в границах данной зоны.

Таких зон должно быть минимум три:

зона общего назначения: помещения для хранения и подготовки биоматериала, выделения и очистки ДНК, мойки и стерилизации посуды;

чистая зона полимеразной цепной реакции (ПЦР): стерильные, оборудованные УФ-облучателями боксированные помещения с приточнонагнетательной вентиляцией для приготовления реагентов, компонентов реакционных смесей, для пробоподготовки и постановки ПЦР;

зона для анализа продуктов амплификации: оборудованные УФоблучателями с вытяжной вентиляцией для проведения электрофореза ДНК, окрашивания гелей и документирования электрофореграмм.

При использовании технологии типирования полиморфизма нуклео-

тидных последовательностей митохондриальной ДНК третья зона должна иметь выделенный компартмент или отдельную зону для постановки секвенирующих реакций, очистки продуктов данных реакций и пробоподготовки для секвенирующего электрофореза

Лаборатория молекулярно-генетических исследований разделена на пять зон/помещений (по числу технологических операций):

1.Зона/помещение выделения нуклеиновых кислот;

2.Зона/помещение подготовки реакционной смеси («чистая» зона»);

3.Зона/помещение предамплификационной;

4.Зона/помещение амплификации нуклеиновых кислот;

5.Зона/помещение электрофореза нуклеиновых кислот и детекции.

Все пять зон являются изолированными комнатами, снабженными предбоксниками и имеющие специальную приточно-вытяжную вентиляцию с фильтрацией воздуха. Все производственные комнаты снабжены коротковолновыми ультрафиолетовыми лампами. Перемещение пробирок, штативов и пр. должно производиться только в одном направлении из «чистой» зоны в зоны предамплификационной, амплификации нуклеиновых кислот и электрофореза через специальные передаточные окна, представляющие собой своеобразные шлюзы и имеющие вытяжную вентиляцию и бактерицидные лампы.

Из материала, исследуемого в первой зоне, выделяют ДНК с последующим измерением её концентрации на спектрофотометре.

7

ВПЦР-боксе второй зоны готовят реакционную смесь для проведения амплификации. Данная зона выделена отдельно в связи с тем, что готовых наборов реакционных смесей для научных исследований не существует.

Впредамплификационной производиться раскапывание ДНК-проб и реакционной смеси.

После этого пробирки поступают в амплификационное помещение, где проводят амплификацию нуклеиновых кислот классическую или в реальном времени (в зависимости от методики исследования).

После классической амплификации, не открывая крышек, пробирки переносят в зону электрофореза и детекции нуклеиновых кислот.

Все операции (выделение ДНК, подготовка реакционной смеси амплификация и электрофорез) должны выполнять разные люди, либо один человек, используя индивидуальную для каждого этапа исследования спецодежду

иобувь, одевая её в предбоксниках. Основной объем работы проводиться в ламинарных шкафах и ПЦР-боксе, обеспечивающих вертикальный поток воздуха для предупреждения контаминации (попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул нуклеиновых кислот, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты).

Основными правилами предотвращения контаминации являются: 1. Разделение функциональных рабочих зон;

2. Соблюдение поточности и направления движения анализируемых образцов;

3. Отдельные лабораторные халаты в каждой рабочей зоне;

4. Одноразовые перчатки без талька; 5. Наконечники для дозаторов с фильтрами, защищающими от аэрозоля;

6. Одноразовые пластиковые пробирки, посуда, наконечники; 7. Химическая и УФ дезинфекция всех поверхностей рабочих зон.

8

2. ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Процедура выделения ДНК из клеток и тканей часто является исходным (основным) этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. При наличии выделенной ДНК, далее становятся возможными ее амплификация (с помощью полимеразной цепной реакции – ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование), клонирование, гибридизация.

В общем случае, для выделения ДНК клетку необходимо разрушить тем или иным способом, а ДНК очистить от других клеточных компонентов. В случае эукариот, нужно отделить ДНК от белков, входящих в состав нуклеопротеидных комплексов хроматина. При этом важно защитить ДНК от действия нуклеаз и максимально сохранить её целостность, поскольку длинные линейные молекулы ДНК при их изоляции от клетки неизбежно фрагментируются.

Выделение нуклеиновых кислот делят на три основных этапа:

Лизис клеток - физический или химический. Так, если мы выделяем нуклеиновые кислоты из листьев растения, то сперва необходимо их протереть (физически нарушить целостность клеток), а потом использовать специальный буфер. Возможно, также понадобится нагревание (для ускорения лизиса) или центрифугирование образцов (для разделения на фракции). В качестве химического агента для лизиса используют специальные буферы. Они могут содержать буферные соли и ионные соли для регулирования pH и осмолярности лизата. Иногда добавляют детергенты, чтобы разрушить клеточную мембрану.

Очистка. После разрушения клеточной и ядерной мембран возникает необходимость удалить примеси - другие вещества, из которых состоят клетки. Добавление концентрированного солевого раствора приводит к выпадению осадка, в котором содержатся белки, липиды и сахара. Если они останутся вместе с ДНК, то изрядно навредят проведению ПЦР и/или секвенированию. Нуклеиновые кислоты остаются в растворе, лучшему отделению их от осадка способствует центрифугирование. Удалению белков также помогает добавление протеазы, которая их расщепляет и позволяет отделять от нуклеиновых кислот. Так можно избавиться, например, от бел- ков-гистонов, на которые «намотана» ДНК в хромосомах.

Элюирование - это отделение ДНК от других веществ и последующее ее концентрирование. Для этого используют увеличение pH примерно до 8. Так как интересующие нас кислоты растворимы в воде, а не в спирте, то добавляют этанол или изопропиловый спирт, Появившийся осадок - это наша ДНК (или РНК). Осадок можно отделить от раствора при помощи центрифугирования. Затем удаляется спирт.

Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы. Для лизиса клеток и денатурации белков часто

9

используется детергент додецилсульфат натрия или хаотропный агент гуанидинизотиоцианат. Если нет необходимости в длинных целых фрагментах ДНК, клетки можно разрушить механическим способом путем перетирания со стеклом или речным песком в жидком азоте.

Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые наборы для выделения ДНК имеют магнитные частицы, покрытые силикой SiO2. Другие наборы предусматривают сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК считается стандартным.

Основные реагенты для выделения:

Трис-буфер - контролирует рН, взаимодействует с липополисахаридами и повышает проницаемость, а также лизирует клеточную мембрану;

ЭДТА - работает как хелатирующий агент, блокируя потребность в кофакторе фермента ДНКазы, тем самым предотвращая деградацию ДНК;

SDS - солюбилизирует белки ядерных и клеточных мембран;

NaCl - нейтрализует отрицательный заряд ДНК, стабилизирует молекулу;

MgCl2 - агент, который защищает и стабилизирует ДНК, блокируя отрицательный заряд липопротеидов;

Фенол – осаждает белковые примеси.

Материалом для исследования, как правило, является венозная кровь, забор которой осуществлялся в объеме 6-8 мл из локтевой вены в пластиковые пробирки (консервант 0,5М раствор ЭД ТА (рН=8.0) с использованием одноразового инструментария. После забора крови для равномерного распределения консерванта необходимо вращать пробирку 6-8 раз. Транспортировка крови может осуществляется в термосе с добавлением льда или использованием хладоэлементов (до 24 часов).

В стандартных исследованиях изучают образцы жидкой или высушенной крови обследуемых лиц. При необходимости вместо образцов крови анализу могут подвергаться и другие объекты: слюна, мазки (соскобы) со слизистой оболочки ротовой полости, абортивный материал, объекты от трупов родителей и ребенка, отдельные кости и их фрагменты, мягкие ткани и др.; допускается проведение сравнительного анализа объектов, используя препараты ДНК, которые были выделены из биологических образцов разного тканевого происхождения;

Для экстракции ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации используют различные методы

(табл.1).

10