книги / Основы биотехнологии

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Лабораторный практикум для студентов очной формы обучения

по направлению 19.03.01 – Биотехнология

Издательство Пермского национального исследовательского

политехнического университета

2017

1

Составители: канд. биол. наук А.В. Виноградова, канд. хим. наук А.В. Портнова, учебный мастер Е.Н. Анашкина

УДК 606(076.5) О-72

Рецензент канд. хим. наук, доц. Д.А. Казаков

(Пермский национальный исследовательский политехнический университет)

Основы биотехнологии : лаб. практикум / сост. А.В. Вино- О-72 градова, А.В. Портнова, Е.Н. Анашкина. – Пермь : Изд-во

Перм. нац. исслед. политехн. ун-та, 2017. – 44 с.

ISBN 978-5-398-01836-3

Подготовлено в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология. Содержит работы, выполняемые студентами на лабораторных занятиях, целью которых является освоение методов культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях, принципов выделения продуктов микробиологического синтеза, оценки их качества и контроля биотехнологических процессов. Для каждой лабораторной работы дан перечень оборудования, реактивов, описаны методики проведения опытов и расчетов, приведены краткие теоретические сведения.

Предназначено для студентов очной формы обучения по направлению 19.03.01 – Биотехнология.

2

3

ТЕМА 1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Лабораторная работа 1 Культивирование клеток микроорганизмов с использованием

ферментационного комплекса Biostat A plus

Целью работы является ознакомление с принципами контроля и управления процессами биосинтеза, с назначением и устройством датчиков рН и рО2, терморегулирующей системой ферментации и т.д. при проведении управляемого процесса культивирования микроорганизмов.

В ходе выполнения работы:

1)необходимо ознакомиться с устройством и правилами эксплуатации комплекса Biostat A plus по инструкции;

2)провести процесс глубинного культивирования микроорганизмов с получением кривой роста и определением сопутствующих показателей;

3)определить жизнеспособность и активность микроорганизмов по измерению дыхательной активности с использованием датчика растворенного кислорода.

Получив задание от преподавателя, необходимо задать и ввести

вблок управления ферментером необходимые автоматически контролируемые условия культивирования, внести посевной материал и приступить к проведению ферментационного процесса.

В ходе ферментации:

– провести отбор проб из ферментера (объем отбираемой пробы 8–10 мл, перед отбором предварительно необходимо слить жидкость из мертвого пространства пробоотборного шланга);

– определить величину оптической плотности суспензии микроорганизмов на ФЭК (кюветы 1–5 мм, длина волны 540 нм), при необходимости готовя соответствующие разведения (водопроводной водой) так, чтобы оптическая плотность суспензии была в интервале 0,05–0,35; показания оптической плотности определять каждые

4

30 мин по трем повторностям (определения нужно выполнять оперативно, поскольку популяция микроорганизмов в отобранной пробе, оставленной в покое в тепле, может еще в течение какого-то времени размножаться; перед приготовлением разведения и определением оптической плотности пробу надо интенсивно встряхнуть, поскольку часть клеток может успеть осесть на дно пробирки или другого сосуда с отобранной пробой);

–контролировать и записывать каждые 15 мин основные параметры ферментации (температуру, концентрацию растворенного кислорода, рН, число оборотов мешалки) по показаниям на индикаторе блока управления ферментера или на мониторе, а также расход воздуха – по показаниям ротаметра и расход титрующего агента – по показаниям на бюретке с титрантом;

–осуществлять микробиологический контроль роста популяции под микроскопом (в начале и в конце занятия); для наблюдения под микроскопом необходимо приготовить препарат типа «раздавленная

капля» и зарисовать картину в поле зрения микроскопа (с объективом 40х);

–осуществлять визуальный контроль над протеканием процесса

иработой установки.

Показания вносят в таблицу по форме:

В отчете по лабораторной работе необходимо представить условия проведения ферментационного процесса, результаты измерений, сведенные в таблицу, графики изменения концентрации биомассы, температуры, рО2, рН, расхода титранта от времени (в случае использования режима автоматического титрования), логарифмическую зависимость изменения концентрации биомассы от времени (с ее помощью найти удельную скорость роста микроорганизмов),

5

кривую зависимости удельной скорости потребления кислорода от концентрации растворенного кислорода dС/(dt×Х) = f(C), данные контроля под микроскопом.

Контрольные вопросы

1. Устройство ферментационного комплекса Biostat A plus

иего возможности.

2.Принцип работы и устройство датчиков рН, рО2, температуры, системы пеногашения, термостатирования, аэрирования.

3.Особенности и возможные ошибки при определении биомассы турбидиметрическим методом.

4.Как связаны между собой время удвоения биомассы и удельная скорость роста?

5.Как рассчитывается удельная скорость роста?

6.От каких факторов зависит расход титранта?

Лабораторная работа 2 Определение интенсивности аэрации сульфитным методом

Развитие популяции микроорганизмов в аэробных условиях невозможно без массообмена между всеми тремя фазами, из которых состоит культуральная среда: твердой (микроорганизмы), жидкой (питательная среда) и газообразной (аэрирующий воздух). Подвод питательных веществ и кислорода к клетке и отвод от нее продуктов метаболизма осуществляются в ходе массообмена между этими тремя фазами. Причем подвод кислорода из-за его малой растворимости и отвод некоторых растворимых газообразных метаболитов, например, диоксида углерода, приходится обеспечивать путем непрерывного барботажа воздухом. Для интенсификации массообменных процессов, как правило, организуется перемешивание реакционной среды, которое нередко сопровождается интенсивным пенообразованием.

Скорость потребления кислорода QO2 пропорциональна сумме

его затрат на рост биомассы, образование продукта и поддержание жизнедеятельности культуры. Поддерживания этот показатель на максимально возможном уровне, можно увеличивать производительность процесса культивирования.

6

Величина QO2 связана с концентрацией растворенного кислорода соотношением:

QO2 = КLa (Ср – С),

где КLa (Коб) – коэффициент массопередачи между газом и жидкостью, определяемый характеристиками культиватора; Ср – равновесная концентрация растворенного кислорода при насыщении жидкости кислородом; С – реальная концентрация растворенного кислорода в жидкости.

Объемный коэффициент массопередачи Коб (КLa) является важнейшей характеристикой культиватора. Величина Коб прежде всего зависит от мощности электродвигателя, типа и частоты вращения мешалки, геометрических форм внутренних конструктивных элементов аппарата. Эти параметры можно изменять как при проектировании, так и в ходе процесса. Однако величина Коб зависит и от физи- ко-химических свойств культуральной жидкости – вязкости, поверхностного натяжения и др. Изменение этих свойств влияет на Коб вследствие изменения поверхностного коэффициента массоотдачи и площади поверхности абсорбции. Известно, например, что добавление к воде 0,1 % уксусной кислоты приводит к уменьшению диаметра барботирующих пузырьков воздуха от 2 до 0,1 мм.

Некоторые вещества (спирты, соли) действуют в еще более малых концентрациях.

Физико-химические свойства культуральных жидкостей в течение цикла культивирования не остаются постоянными. Это связано с тем, что происходит выделение продуктов метаболизма, изменяются количество и состав взвешенной твердой фазы, добавляются пеногасители. Известны факты снижения или увеличения Коб в 2–3 раза при культивировании.

Имеющиеся зависимости для расчета Коб являются эмпирическими и содержат различные коэффициенты, определяемые экспериментально.

Методы определения Коб делятся на прямые и косвенные. Прямое определение коэффициента массообмена в реальных условиях культивирования, когда среда содержит суспендированные микроорганизмы, является лучшим способом оценкикультиватора.

7

При необходимости сравнения массообменных возможностей аппаратов различных объемов и конструкций безотносительно ка- кой-либо конкретной питательной среды и вида микроорганизма удобнее пользоваться косвенными методами, основанными на применении модельных сред.

Одним из методов оценки растворения (абсорбции) кислорода является сульфитный метод, с помощью которого определяется не сам объемный коэффициент абсорбции кислорода, а так называемое сульфитное число Qs.

Сульфитный метод. В основе этого метода лежит реакция окисления сульфита натрия в присутствии катализатора – ионов меди или кобальта:

2Na2SO3 O2 Cu2 , Co2 2Na2SO4 .

Избыток остающегося сульфита определяется обратным йодометрическим титрованием или колориметрическим путем. Концентрации сульфита применяются от 0,2 до 1 н. Скорость химической реакции окисления сульфита значительно выше скорости абсорбции, поэтому общая скорость процесса определяется скоростью абсорбции. Определяемый этим методом сульфитный коэффициент (сульфитное число) Qs характеризует скорость абсорбции кислорода

вданном аппарате. Обычно (колеблется от 0,5 до 5 и редко достигает

10 ммоль О2/(л·мин). Qs определяется физико-химическими свойствами раствора сульфита и гидродинамическими параметрами системы, поэтому данный коэффициент может быть использован лишь для относительного сравнения массообменных возможностей аппаратов. При переходе к аэрации культуральной жидкости скорость абсорбции кислорода может быть совсем иной.

Поскольку реакция между растворенным кислородом и сульфитом протекает очень быстро, концентрация растворенного кислорода

всреде равна нулю, и тогда Qs = Коб ·Ср.

Обычно величина Коб, определенная сульфитным методом, выше найденной прямыми методами. Известно лишь то, что эта реакция очень чувствительна к катализу и ингибированию. Даже весьма незначительные отличия в качестве сульфита или наличие следов поверхно-

8

стно-активных веществ могут существенно изменить значение Qs. Все это ограничивает возможности применения сульфитного метода для оценки массообменных характеристик культиваторов.

Посуда, оборудование, реактивы

1)колбы конические на 500 мл – 2 шт.;

2)колбы конические на 250 мл – 2 шт.;

3)колбы конические на 100 мл – 2 шт.;

4)часовые стекла – 2 шт.;

5)бюретка на 50 мл – 2 шт.;

6)пипетки Мора на 5 мл – 2 шт.;

7)тиосульфат натрия 0,1 н раствор;

8)крахмал 1 % раствор;

9)йод 0,1 н раствор;

10)сульфит натрия 0,8 н раствор с 0,001 М раствором сернокислой меди.

Ход анализа

Определение объема раствора йода, необходимого для работы

В коническую колбу на 250 мл отбирают 5 мл свежеприготовленного 0,8 н раствора сульфита и приливают к нему из бюретки раствор йода до появления коричневой окраски. Так определяют необходимый объем раствора йода (α). Затем добавляют 0,5 мл 1% раствора крахмала и титруют 0,1 н раствором тиосульфата до исчезновения синей окраски. На титрование должно пойти 1–3 мл тиосульфата. Далее проверяют правильность определения объема йода (α): в чистую колбу на 250 мл наливают (α) мл 0,1 н раствора йода и титруют его тиосульфатом до обесцвечивания. Если объем йода подобран правильно, то на его титрование идет около 35–45 мл тиосульфата.

Определение сульфитного числа до и после аэрации

Для анализа наливают 100 и 300 мл 0,8 н раствора сульфита в конические колбы на 500 мл. Затем из каждой колбы отбирают по 5 мл сульфита в конические колбы на 250 мл, в которые заранее наливают по (α) мл раствора йода с избытком 5 мл (увеличить значение α).

9

Если α подобрано неправильно, раствор становится бесцветным (данного количества йода оказалось недостаточно), необходимо увеличить α ещё на 5 мл. Колбы закрывают часовыми стеклами и оставляют в темноте на 5–10 мин, затем споласкивают часовые стекла дистиллированной водой в ту же колбу, которую они закрывали, и титруют содержимое 0,1 н тиосульфатом. Количество тиосульфата в мл (Пн) записывают в таблицу.

Колбы с разными объемами сульфита помещают на 20 мин на качалку (время включения и выключения качалки замечают с точностью до 1 мин). К моменту выключения качалки в 2 колбы на 250 мл наливают подобранный для работы раствор йода (α). Значение α должно быть одинаковым на протяжении всей работы (учесть дополнительное увеличение значения α). Остановив качалку, отбирают из встряхиваемых колб по 5 мл раствора сульфита и приливают пробы к раствору йода. Снова включают качалку еще на 20 мин. Отобранные пробы выдерживают в темноте и титруют 0,1 н раствором тиосульфата, как указано выше. Количество мл тиосульфата (Пх1) записывают в таблицу. В ту же таблицу вносят результаты (Пх2), полученные титрованием пробы сульфита, отобранной вторично.

Сульфит при аэрировании окисляется в сульфат, следовательно, на его связывание требуется все меньше йода и, соответственно, все больше тиосульфата идет на титрование свободного йода.

Расчет сульфитного числа

Скорость поступления кислорода в раствор сульфита: Qs Пх Т Пн 0,8 k, мг О2/л·мин,

где Пн – количество мл 0,1 н раствора тиосульфата, пошедшее на титрование 5 мл раствора сульфита до аэрации; Пх – количество мл 0,1 н раствора тиосульфата, пошедшее на титрование 5 мл раствора сульфита после аэрации; Т – время аэрации, мин; 0,8 – количество мг кислорода, идущее на окисление 1 мл 0,1 н раствора тиосульфата; k – коэффициент перерасчета на 1 л сульфита; в данном случае он равен 200, так как на титрование берут 5 мл сульфита.

10