книги / Методы выделения и очистки биопрепаратов в решении задач биотехнологии

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

Кафедра химии и биотехнологии

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БИОПРЕПАРАТОВ В РЕШЕНИИ ЗАДАЧ БИОТЕХНОЛОГИИ

Методические указания к лабораторным работам

Издательство Пермского национального исследовательского

политехнического университета

2016

1

Составители: Д.А. Казаков, Л.Д. Аснин, Л.В. Аникина, Л.С. Пан, А.В. Портнова

УДК 602.4 (076.5) М54

Рецензент канд. хим. наук, доцент М.М. Соколова

(Пермский национальный исследовательский политехнический университет)

Методы выделения и очистки биопрепаратов в решении М54 задач биотехнологии : метод. указания к лабораторным работам / сост. Д.А. Казаков, Л.Д. Аснин, Л.В. Аникина, Л.С. Пан, А.В. Портнова. – Пермь : Изд-во Перм. нац. исслед. политехн.

ун-та, 2016. 20 с.

Составлены в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом по направлению подготовки 19.03.01 «Биотехнология», рабочей программой дисциплины «Методы выделения и очистки биопрепаратов». Для каждой лабораторной работы дан переченьоборудования, реактивов, описаныметодикипроведенияопытови расчетов. Каждаяработасодержитконтрольныевопросы.

Предназначены для студентов очной формы обучения по направлению 19.03.01 «Биотехнология».

УДК 602.4 (076.5)

© ПНИПУ, 2016

2

3

ВВЕДЕНИЕ

Лабораторные работы по дисциплине «Методы выделения и очистки биопрепаратов» проводятся с целью приобретения студентами навыков и умений выделения и очистки биомолекул из биологического материала с использованием необходимых реактивов и оборудования. Также проведение лабораторных работ позволяет подтвердить теоретические положения и выводы по отдельным вопросам дисциплины и тем самым закрепить знания о методах выделения и очистки биопрепаратов.

Лабораторные работы оформляются каждым студентом в отдельной тетради согласно следующему плану:

1.Дата.

2.Название лабораторной работы.

3.Цель работы.

4.Принципы выделения и идентификации биомолекул.

5.Техника выполнения работы.

6.Уравнения протекающих реакций.

7.Наблюдаемые явления.

8.Выводы по работе.

В конце каждой работы даются контрольные вопросы, которые помогут при подготовке лабораторной работы к защите.

Лабораторная работа № 1 ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ

Цель работы: овладеть навыками осаждения белков из водных растворов органическими растворителями.

Существует большое количество разнообразных реакций осаждения белков. Как правило, реакции осаждения являются первой стадией процесса выделения, очистки, качественного и количественного определения отдельных белков. В зависимости от применяемого осадителя реакции осаждения могут быть обратимыми и необратимыми. В случае обратимых реакций белки не подвергают-

4

ся глубоким изменениям, и получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе, обычно в воде. Белки при этом сохраняют свои нативные свойства. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям (денатурации), утрачивают свои биологические и физикохимические свойства, становятся менее гидрофильными и теряют способность растворяться в воде.

Исследуемыйматериал: 1%-ныйводныйрастворяичногобелка.

Реактивы:

1.Этиловый спирт 96 %.

2.10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

3.Насыщенный раствор хлорида натрия.

Оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Пипетки.

Ход работы:

1.Осаждение белков спиртами. Метод основан на способно-

сти органических спиртов нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению осадка белка.

При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция происходит лучше в присутствии электролита (например, хлорида натрия) вследствие снятия заряда с частиц белка.

Реакция осаждения белка спиртом при кратковременном действии спирта на холоде обратима. Если осадок быстро отделить от спирта, то белок сохранит нативное состояние и может быть вновь растворен в воде. При длительном воздействии спирта наступает необратимая реакция осаждения, т.е. денатурация белка.

К 5 каплям раствора исследуемого белка приливают 15 20 капель этилового спирта. Раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия. При стоянии выпадает осадок белка.

5

2.Осаждение белков органическими кислотами. Метод ос-

нован на способности органических кислот вызывать нейтрализацию заряда молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка. Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков.

Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков. При использовании трихлоруксусной кислоты в качестве осадителя удается отдельно определить содержание азота белков и азота других азотсодержащих веществ (мочевины, аминокислот и др.), присутствующих в растворе.

К 5 каплям исследуемого раствора белка добавляют 2 капли 10%-ного растворатрихлоруксуснойкислоты. Выпадает осадокбелка.

Контрольные вопросы:

1.Какие уровни структурной организации белковых молекул вы знаете? За счет каких связей они образуются?

2.Чем обусловлены реакции осаждения белков?

3.Чем может быть вызвана денатурация белков?

Лабораторная работа № 2 ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ

Цель работы: овладеть навыками выделения белков из водных растворов методом высаливания.

Высаливание процесс осаждения белков солями аммония, щелочных и щелочно-земельных металлов ((NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl, KCl, MgSO4, MgCl2 и др.). Все вещества этого типа нейтрализуют заряд белковых молекул и вызывают их дегидратацию, что ведет к коагуляции белковых молекул и их осаждению. Осаждение белков при высаливании является обратимым, при растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных физико-химических и биологических свойств.

Белки отличаются друг от друга зарядом и гидрофильностью, поэтому можно разделить белки, используя для их осаждения разные концентрации солей в среде.

6

Метод высаливания используют для разделения смесей белков на фракции и определения их соотношения. Осажденную фракцию белка можно отделить центрифугированием или фильтрованием. После этого можно растворить выделенную фракцию и количественно определить ее содержание в исходной смеси с помощью различных методов.

Высаливание применяют также для очистки и получения кристаллических препаратов белков.

Метод высаливания используют как в лабораторной практике, так и промышленной биотехнологии.

Исследуемый материал: раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка и растворяют в 230 мл дистиллированной воды, к которой прибавляют 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия; раствор фильтруют через марлю, сложенную в несколько слоев).

Реактивы:

1.Хлориднатрия, кристаллический, тонко растертый порошок.

2.Сульфат аммония, кристаллический, тонко растертый по-

рошок.

3.Сульфат аммония, насыщенный водный раствор.

4.Сульфатмагния, кристаллический, тонко растертый порошок.

5.Гидроксид натрия, 10%-ный водный раствор.

6.Сульфат меди, 1%-ный водный раствор.

7.Уксусная кислота, 1%-ный водный раствор.

Оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Пипетки.

3.Воронки для фильтрования.

4.Бумажные фильтры.

Ход работы:

1. Осаждение белков сульфатом аммония. В пробирку нали-

вают 2 3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

7

К фильтрату малыми порциями при перемешивании добавляют тонко растертый порошок сульфата аммония до получения насыщенного раствора (т.е. до тех пор, пока последняя порция соли уже не будет растворяться). Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.

С фильтратом проделывают биуретовую реакцию: в пробирку наливают 2 мл фильтрата, затем прибавляют равный объем раствора гидроксида натрия и 1 2 капли раствора сульфата меди. Если произошло полное осаждение белков, то биуретовая реакция будет отрицательной, т.е. сине-фиолетовое окрашивание не проявится.

2.Осаждение белков сульфатом магния и хлоридом натрия.

Вдве пробирки наливают по 2 3 мл раствора яичного белка и добавляют малыми порциями при перемешивании (до получения насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлорида натрия,

в другую сульфата магния. Через 5 6 минут в пробирках начинается выпадение осадка глобулинов. Альбумины в нейтральных растворах солей щелочныхи щелочноземельных металловнеосаждаются.

Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. Фильтраты подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты, при этом появляется осадок альбуминов. Осадок отфильтровывают, а в фильтратах с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.

Результаты работы записывают в табл. 1.

Таблица 1

Осаждение белков под действием различных высаливающих веществ

В выводе указать на возможность разделения белков методом высаливания, принцип его и отличия от осаждения путем денатурации.

Контрольные вопросы:

1.Что такое высаливание белков?

2.Какие вещества используются для высаливания белков?

3.Почему разные белки осаждаются при различных концентрациях высаливающего вещества?

4.Для каких целей используется высаливание?

Лабораторная работа № 3 ДИАЛИЗ БЕЛКОВ

Цель работы: овладеть навыками очистки растворов белков от низкомолекулярных примесей методом диализа.

Очистка растворов белков от низкомолекулярных примесей методом диализа основана на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать низкомолекулярные органические (моносахариды, аминокислоты, карбоновые кислоты, спирты и др.) или неорганические (ионы солей) примеси.

Для осуществления диализа применяют-

9

паратов (например, ферментов). Диализ положен в основу работы аппарата «искусственная почка», который применяется для очищения крови от низкомолекулярных конечных продуктов метаболизма, образующихся в результате жизнедеятельности человека.

Исследуемый материал: раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 20-кратном объеме дистиллированнойводы, фильтруютчерез несколько слоев марли).

Реактивы:

1.Сульфат аммония, насыщенный водный раствор.

2.Хлорид бария, 5%-ный водный раствор.

3.Гидроксид натрия, 10%-ный водный раствор.

4.Сульфат меди, 1%-ный водный раствор.

5.Уксусная кислота, 1%-ный водный раствор.

Оборудование:

1.Целлофан, разрезанный на куски размером 125 × 125 мм.

2.Стакан химический на 1000 мл.

3.Стеклянные палочки.

4.Резиновые колечки.

5.Штатив с пробирками.

6.Пипетки.

Ход работы:

К 5 мл раствора яичного белка добавляют каплю насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Отбирают в две пробирки по 10 капель раствора и проделывают в одной из них биуретовую реакцию (см. лабораторную работу № 2), а в другой – пробу на сульфаты. При проведении пробы на сульфаты в анализируемый раствор добавляют 2 3 капли раствора хлорида бария, появление белого осадка говорит о наличии сульфат-ионов в растворе.

Целлофану, предварительно замоченному в дистиллированной воде, придают форму мешочка, который примерно на 1/3 заполняют исследуемым раствором белка с примесью сульфата аммония. Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, которые прижимают друг к другу с помощью надетых с двух концов резиновых колечек. Мешочек погружают в стакан с дистилли-

10