ВВЕДЕНИЕ

УДК 619:576.8 ББК48.4Р 13

Печатается по постановлению Редакционно-издательского совета АНТ

Рецензенты: зав. кафедрой микробиологии Казанского госу­дарственного университета, докт. биол. наук, профессор, дейст-вит. член АН Республики Татарстан И. Б. Лещинская; зав. кафед­рой микробиологии Казанской государственной академии вете­ринарной медицины, докт. ветер, наук, профессор Р. Г. Госманов.

Равилов А. 3., Гильмутдинов Р. Я., Хусаинов М. Ш.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ. Казань: Фэн, 1999.-398 с.

В книге проанализированы микробиологические среды и ис­пользование их в различных областях биологии, медицины и ве­теринарии как в нашей стране, так и за рубежом. Особое внима­ние уделено наиболее часто используемым компонентам микро­биологических сред, информация о которых относительно слабо освещена в современной литературе. Приводятся сведения о со­временных средах, анализируются их достоинства и недостатки, рассматривается история изучения вопроса. Максимально полно исследован вопрос использования сред при работе с такими ин­фекционными агентами, как энтеробактерии, микобактерии, микоплазмы, стрепто- и стафилококки, грибы.

Книга рассчитана на практических врачей и научных сотруд­ников ветеринарного и медицинского профиля, работающих в области микробиологии, микологии и инфекционной патоло­гии, а также специалистов гос.-сан. эпидемиологической служ­бы, пищевой и микробиологической промышленности.

Конструирование и производство качественных стандартных питательных сред—одна из важнейших проблем биотехнологии, медицинской и ветеринарной микробиологии (Смирнова Г. А., 1991).

Несмотря на успехи, достигнутые в борьбе с инфекционными болезнями, уровни заболеваемости в мире остаются высокими: появляются новые болезни; отмечается возвращение старых, ко­торые считались практически искорененными. В Латинской Америке участились случаи холеры, в России—резко увеличи­лось число заболевших дифтерией. Наблюдается распростране­ние болезней Лайме, легионеров, синдрома токсического шока и других (Ecologist, 1995). В структуре причин смертей в Европе инфекционные болезни занимают 3-е место, уступая лишь сер­дечно-сосудистой патологии и онкологическим заболеваниям. В США при ранжировании причин смертей инфекционные болез­ни вышли на 4-е место. Успешная борьба с инфекциями возмож­на лишь при условии истинности диагноза и хорошо налаженно­го эпидемиологического надзора с использованием широкого спектра лабораторных методов. Система эпид. надзора предпо­лагает обязательное применение данных микробиологических исследований (Покровский В. И. и соавт., 1995).

По информации ВОЗ ежегодно в мире острые кишечные ин­фекции (ОКИ) переносят 2 млрд. человек. Этиологическая стру­ктура ОКИ в разных странах существенно разнится. Так, в Вели­кобритании 1-е место среди бактериальных ОКИ занимает кам-пилобактериоз, во многих странах Европы—сальмонеллезы, в Японии—заболевания, вызываемые парагемолитическим вибри­оном. В России же из более чем 5 млн. случаев ОКИ, зарегистри­рованных за последние 10 лет, этиология половины (55,6%) не установлена. Из расшифрованных—1-е место принадлежит ши-геллезам. Широко распространенный кампилобактериоз диаг­ностируется плохо из-за отсутствия необходимого лабораторно­го оборудования и недостаточного знакомства медработников с методами выделения микроаэрофильных бактерий.

За последние 10 лет отмечена тенденция роста заболеваемо­сти чумой в мире, с ежегодным темпом прироста на 12,5%, что связано с активацией эпидемиологического процесса в Африке. В Азии эта цифра составляет 18,5%. Последняя вспышка в Ин­дии выявила неподготовленность органов здравоохранения. Эпидемиологическую ситуацию по России следует считать неус­тойчивой в связи с наличием возбудителя чумы в его резервуарах и опасностью завоза из-за границы (Мишанькин Б. Н. и соавт., 1995).

Поданным ВОЗ 1/3 населения мира заражена М. tuberculosis,aSchultzeG. (1992) считает, что показатель инфицированности населения мира туберкулезом достигает 50%. Ежегодно регист-

ISBN 5-7544-0137-Х

© Издательство «Фэн». 1999

3

рируется 8—10 млн. случаев туберкулеза и 3—4 млн. человек уми­рают. Стало увеличиваться число случаев туберкулеза в европей­ских странах. В США с 1988 по 1993 годы туберкулез у детей воз­рос на 40%, преимущественно за счет городского контингента.

В системе Гос. сан.-эпид. надзора РФ потребителями микро­биологических сред являются лаборатории бактериологические и особо опасных инфекций. 1-ые занимаются идентификацией возбудителей пищевых отравлений и воздушно-капельных ин­фекций, а 2-ые—возбудителей бруцеллеза, чумы, листериоза, ле-гионеллеза, туляремии, лептоспироза, туляремии, сибирской яз­вы, холеры и бореллиоза. Используются среды при исследовании фармацевтического сырья, антибиотиков, витаминов и космети­ческих средств; питьевых, промышленных и сточных вод; моло­ка и молочных продуктов; мяса и мясных продуктов, яиц, хлебо­булочных изделий и напитков.

Потребителями сред для микобактерий является противоту­беркулезная служба МЗ РФ, а среды для культивирования возбу­дителей сифилиса, гонореи и кожных заболеваний (грибы) при­меняются в учреждениях дермато-венерологического профиля.

Крупномасштабно используются питательные среды в мик­робиологической промышленности для культивирования пато­генных микроорганизмов с целью изготовления вакцин, а также при культивировании микроорганизмов—продуцентов ценных биологически активных продуктов.

К сожалению, даже в относительно благополучные времена существования СССР ассортимент выпускаемых у нас питатель­ных сред намного уступал таковому ведущих зарубежных стран: США, ФРГ, Великобритании (Смирнова Г. А., Муравьева В. А., 1984). В связи с напряженной эпидемиологической обстановкой в Российской Федерации (увеличение заболеваемости дифтери­ей, туберкулезом, сифилисом, природно-очаговыми и зооноз-ными инфекциями; высокий уровень заболеваемости коклю­шем, дизентерией, брюшным тифом, сальмонеллезом, гонореей и внутрибольничными инфекциями), одной из основных задач Министерства здравоохранения является расширение ассорти­мента и совершенствование качества питательных сред (Они-шенко Г. Г., 1997).

После разрушения системы централизованного обеспечения микробиологическими средами образовавшуюся нишу достаточ­но активно и успешно заполнило большое количество фирм, представительств и предприятий, специализирующихся как на их производстве и реализации, так и на чисто посреднических функциях. При этом цены и качество реализуемой продукции за­частую значительно варьируют. Достаточно активно внедряются на наш рынок иностранные компании из США, Англии, Фран­ции, Испании, Германии, Индии и других стран. Между тем, по­ложение потребителей затрудняется отсутствием полной инфор­мации об этих организациях и их продукции.

Определенные трудности испытывают сотрудники научно-исследовательских учреждений и ВУЗов при изготовлении ми­кробиологических сред в связи с дефицитом многих компонен­тов тех или иных рецептур, обилием самих рецептур и в целом, с отсутствием обобщающего современного анализа этих вопро­сов.

Учитывая изложенное, мы в представленной работе попыта­лись обобщить литературу по микробиологическим средам, в ос­новном за последние 10—15 лет.

1. Основные представления о микробиологических средах и их компонентах

1.1. Классификация сред, терминология

Большинство существующих классификаций сред достаточ­но условно и не всегда обосновано, что отмечается и самими ав­торами (Семенов С. М., 1990 и др.).

По составу микробиологические среды подразделяются на ес­тественные (натуральные), искусственные (полусинтетические) и синтетические (Блинов Н. П. и соавт., 1988; Семенов С. М., 1990). Однако Федоров Р. В. (1990), характеризуя состав сред, использу­ет термины «безбелковые», «белковые» и «минеральные», а деление на естественные и искусственные, на его взгляд, это классифика­цияпо происхождению.

По консистенции среды могут быть жидкими (бульоны), полу­жидкими (с добавлением 0,3—0,7% агара), полуплотными, плот­ными (1,5—2% агара), а также, по классификации Блинова Н. П. и соавт. (1988),сыпучими и сухими. Сыпучие среды используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в мик­робиологической и медицинской промышленности. Это разва­ренное пшено и кварцевый песок, пропитанный питательным раствором. Сухие среды представляют собой гигроскопические порошки или гранулы с влажностью до 10%. Гранулированная форма имеет ряд преимуществ по сравнению с порошкообраз­ной: при работе с ней образуется меньше мелкодисперсной пы­ли, которая может вызвать аллергические реакции; кроме того, гранулы не прилипают к стенкам сосудов, облегчая, тем самым, взятие навесок; быстро пропитываются водой и образуют рас­творы, не содержащие комочков (Подунова Л. Г. и соавт., 1996). Часто используются в качестве синонимов термины «твердые», «полутвердые», «мягкие». В некоторых случаях для уплотнения сред применяется желатин (10—15%) и силикагель. Ряд естест­венных питательных сред (свернутые сыворотка крови, яичный белок) сами по себе являются плотными (Борисов Л. Б. и соавт., 1993).

4

5

По целевому назначениюсреды делятся наосновные (пита­тельные основы), элективные и дифференциально-диагностиче­ские (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). Лабинская А. С. (1978) подраз­деляет среды по этому принципу на общего назначения и специаль­ные, относя к последним элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические. Под средами общего на­значения фактически рассматриваются питательные основы: мя-со-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ) и др. В то же время Федоров Р. В. (1990), опираясь на данный крите­рий, выделяет среды обычные или простые, специальные или элек­тивные и дифференциально-диагностические. Таким образом, дифференциально-диагностические среды по непонятным, во всяком случае для нас, соображениям выделяются им из специ­альных сред в самостоятельную группу. Семенов С. М. (1990) по назначению среды разделяет на дифференциально-диагностиче­ские, элективные, накопительные (обогащения, накопления), ингибиторные, селективные, индикаторные и консервирующие (транспортные).

Виестур У. Э. и соавт. (1980) классифицируют питательные среды по назначению на диагностические и производственные. Первые предназначены в основном для обнаружения, выделения и идентификации патогенных микроорганизмов по морфологи­ческим и биохимическим признакам и, в свою очередь, делятся на элективные, обогатительные, консервирующие и дифферен­циально-диагностические. Производственные среды подразде­ляются по составу на посевные и основные ферментационные, приготовленные в большинстве случаев на полупродуктах и от­ходах сельскохозяйственного и пищевого производства с добав­ками минеральных солей.

Требования к производственным средам: максимальный вы­ход продукции (в частности, токсинов и др.) и бактериальной массы, дешевизна. Проблемой является загрязнение бактериаль­ной массы компонентами культуральной среды, в частности бел­ками сыворотки крови, вынуждающее использовать многократ­ное отмывание и концентрирование.

На наш взгляд, по целевому назначению среды можно было бы классифицировать как культуральные, дифференциально-диаг­ностические, производственные испециальные.

Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С. (1981), Блинов Н. П. и со­авт. (1988) подразделяют среды на 4 группы: универсальные (обычные или простые, по терминологии Блинова Н. П. и соавт., 1988) специальные, избирательные (элективные) и дифференциаль­но-диагностические. При этом «универсальные» (по терминоло­гии Пяткина К. Д., Кривошеина Ю. С., 1981) и «основные» (по терминологии Борисова Л. Б. и соавт., 1993) среды фактически представляют собой одну и ту же группу.

В «Руководстве по микробиологии, клинике и эпидемиоло­гии инфекционных болезней (М., 1962) диагностические среды

б

делятся на консервирующие, обогащения, элективные и дифферен­циально-диагностические.

В более позднем «Руководстве по микробиологической ди­агностике инфекционных болезней» (М., 1973) среды делятся на 3 группы: 1. для культивирования, включающие универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования;2. для выделения и накопления, включающие среды консервирую­щие, накопления и элективные; 3. для идентификации, включаю­щие дифференциальные и элективно-дифференциальные.

Дифференциально-диагностические среды—предназначены для разграничения отдельных видов или групп микроорганиз­мов. Принцип их построения основан на видовом различии в биохимической активности бактерий вследствие неодинакового набора ферментов (Борисов Л. Б. и соавт., 1993), а также по культуральным свойствам (Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981). В состав этих сред входят: питательная основа, обеспечи­вающая размножение бактерий; определенный углевод, различ­ное отношение к которому является диагностическим призна­ком данного вида бактерии; цветной индикатор рН (например, индикатор Андреде), свидетельствующий о сдвиге рН в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). К ним относят среды для опреде­ления протеолитической, гемолитической и восстановительной (редуцирующей) способностей микробов, ферментации углево­дов, а также среды, содержащие вещества ассимилируемые только определенными микробами.

К группе дифференциально-диагностических относят и се­лективные среды, предназначенные для дифференциации про-то- и ауксотрофных бактерий (Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981).

Рекомендуется 5 критериев для оценки селективных сред MosselD. (1986).Продуктивность—соотношение между коли­чеством колоний выделяемого вида бактерий, выросших на се­лективной среде с и без селективных агентов.Селективность— соотношение между количеством колоний ингибируемых ви­дов бактерий выросших на селективной среде с и без селективных агентов.Дифференциабельность (элективность)— способность легко различать на селективной среде колонии разных видов бактерий.Действенность—выделение при ис­пользовании данной селективной среды из образцов искомых видов бактерий и ингибирование сопутствующих.Системати­ческая необъективность—пределы, в которых использование данной селективной среды ограничивает выделение из образ­цов того или иного вида бактерий или биотипа искомой груп­пы, или вида бактерий.

В универсальном варианте селективная среда должна удовле­творять следующим требованиям: обеспечивать рост 100% штам­мов конкретного вида микроорганизма, даже при наличии еди-

7

ничных клеток в пробе; полностью подавлять рост любых видов сопутствующей микрофлоры; не изменять видовые свойства ис­следуемого микроорганизма; быть простой в изготовлении и не содержать дефицитных или дорогостоящих компонентов (Рожа-вин М. А., Бугаева Е. И., 1986).

Элективными называются среды для избирательного выделе­ния и накопления микроорганизмов определенного вида или группы из материалов, содержащих разнообразную посторон­нюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологиче­ских особенностей конкретных микроорганизмов, отличающих их от большинства других. Например, избирательный рост ста­филококков наблюдается при повышенной концентрацииNaCl, холерного вибриона—в щелочной среде и т. д. (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). К ним относятся среды обогащения (накопления,enrichment), в которых интересующий исследователя вид рас­тет интенсивнее и быстрее сопутствующей микрофлоры (Пят-кин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981). В свою очередь, Кали­на Г. П., Комзолова Н. Б. (1988) в обзоре, касающемсяPs.aerugi­nosa, подразделяют среды накопления на неселективные и инги-биторные.

Специальные среды—предназначены для выращивания бакте­рий, не размножающихся на «универсальных» («основных») сре­дах. К ним относятся кровяной агар, сывороточные агар и бульон и др. Как специальные, очевидно, можно рассматривать ивос­становительные среды, а также среды для определения антибиоти-кочувствительности микроорганизмов. К последним относятся агар АГВ (НПО «Питательные среды», Махачкала) и его зарубеж­ные аналоги—агары Мюллера-Хинтона и ИзоСенситест. Ксожалению переход в ближайшем будущем микробиологических лабораторий нашей страны к использованию агара Мюллера-Хинтона, в соответствии с наиболее часто применяемыми в меж­дународной практике стандартами Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS) не представляется возможным (Козлов Р. С. и соавт., 1996).

Краткую инструкцию по классификации питательных сред, значению отдельных ингредиентов, входящих в них, их пригото­влению и хранению предлагает KreuzerК. (1994).