2 курс / Микробиология 1 кафедра / Экзамен микробик / metodichka_4

шенной пространственной конфигурацией молекулы (α-спираль нормального белка заменяется на β-конформацию). Формируются крупные конгломераты инфекционных прионов, что приводит к губкообразному перерождению серого и белого вещества головного мозга и развитию медленной летальной инфекции.

Прионы высоко резистентны ко многим факторам их инактивации. Явля-

ясь нормальными белками человека, они не вызывают защитных реакций (вос-

паление, выработка антител и др.).

7. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Молекулярно-биологический: обнаружение специфических участков ви-

русной нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Теоретически данный метод позволяет обнаружить участок одной молекулы вирусной ДНК или РНК в любом образце биологического материала. Принцип ПЦР: многократное образование (гибридизация) копий специфического участка нуклеиновой кислоты вируса с последующей их идентификацией методом электрофореза.

Определение вирусных антигенов (экспресс-диагностика): вирусные ан-

тигены определяют в крови и других биологических жидкостях с помощью се-

рологических реакций, чаще это РИФ и ИФА (см. учебно-методическое посо-

бие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии»).

Вирусологический: заражение исследуемым материалом биологической модели (куриный эмбрион, культура клеток, организм животного) с последую-

щей индикацией, а затем идентификацией обнаруженных вирусов.

Для размножения вирусов в курином эмбрионе исследуемый материал вводят в аллантоисную или амниотическую полость (культивируют вирусы гриппа, эпидемического паротита и др.).

Для размножения вирусов в культуре клеток исследуемым материалом заражают живые клетки различного происхождения: эмбриональные, нормаль-

ных тканей, опухолевые (культивируют вирусы полиомиелита, аденовирусы и др.).

11

Для размножения вирусов в организме лабораторных животных исполь-

зуют белых мышей (культивируют вирусы бешенства, клещевого энцефалита).

Помимо диагностики вирусных инфекций, культивирование вирусов про-

водят с целью получения вакцинных и диагностических препаратов.

Вирусоскопический: обнаружение в исследуемом материале включений,

образующихся в пораженных клетках при вирусной инфекции. Включения представляют собой скопления вирусов и продуктов реакции клетки на вирус-

ную инфекцию. Включения могут располагаться в цитоплазме или в ядре клет-

ки-хозяина. Чаще внутрицитоплазматические включения образуют РНК-

содержащие вирусы (например, включения Бабеша-Негри при бешенстве).

Внутриядерная локализация включений в большей степени характерна для ДНК-содержащих вирусов (например, включения при цитомегаловирусной ин-

фекции). В мазках видны гигантские клетки с внутриядерными включениями вирусов, напоминающие «совиный глаз» (рисунок 4).

Рисунок 4 – Включения при цитомегаловирусной инфекции (клетки «со-

виный глаз»)

Серологический: определение противовирусных антител в сыворотке крови больного. Особенностью серологического метода диагностики вирусных инфекций является исследование парных проб сыворотки. Первую пробу сыво-

ротки берут у больного в начале заболевания, а вторую – через 10-14 дней. О

вирусной инфекции свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра ан-

12

тител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностически значи-

мой является сероконверсия для взрослых в 4 раза, а для детей – в 2 раза.

Практическая работа

1. Изучение под микроскопом готовых препаратов включений Бабеша-

Негри (окраска по Селлерсу). Краситель Селлерса состоит из 2-х частей 1%

раствора метиленовой сини в метиловом спирте и 1 части 1% раствора основ-

ного фуксина в метиловом спирте. Этот краситель наносят на 1-5 секунд на влажный, нефиксированный мазок-отпечаток из ткани мозга, чаще из области гиппокампа (аммонова рога) человека или животного, погибшего от бешенства.

При световой микроскопии с иммерсионной системой на голубом фоне цито-

плазмы нейронов видны ярко-красные включения Бабеша-Негри. Включения четко контурированы, имеют овальную или продолговатую форму и зернистую структуру.

2. Вирусологический метод диагностики.

а) культивирование вирусов в курином эмбрионе.

I этап исследования: заражение куриных эмбрионов в аллантоисную по-

лость материалом от больного с подозрением на гриппозную инфекцию.

С помощью овоскопа определяют расположение и границы воздушной ка-

меры (отметить карандашом). Скорлупу яйца в области воздушной камеры об-

рабатывают спиртовым раствором йода. Пробойником делают отверстие в цен-

тре камеры, затем шприцем вводят вируссодержащую жидкость в количестве

0,1-0,2 мл в аллантоисную полость. Отверстие парафинируют. Зараженные эм-

брионы помещают в термостат при 370С на 48 часов.

б) культивирование вирусов в культуре клеток Нер-2.

I этап исследования: приготовление перевиваемой культуры клеток Нер-2.

Для получения монослоя культуры клеток количество клеток во взвеси подсчитывают в камере Горяева. Взвесь клеток разводят средой 199 до количе-

ства 100 тысяч клеток в 1мл. В стерильный пенициллиновый флакон вносят стерильной пипеткой над пламенем спиртовки 1мл взвеси клеток в питательной

13

среде 199, закрывают флакон стерильной резиновой пробкой. На флаконе ка-

рандашом по стеклу проводят продольную черту. Затем помещают флакон в специальный штатив в горизонтальном положении, чертой кверху, и ставят в термостат при 370С на 3-5 дней для получения монослоя клеток на стенке фла-

кона.

II этап исследования:

 микроскопический контроль выросшей культуры клеток Нер-2. Под ма-

лым увеличением микроскопа просматривают культуру клеток. Для заражения отбирают флаконы с полноценным монослоем (видны прозрачные, блестящие клетки, имеющие отростки, прикрепленные к стеклу);

 заражение культуры клеток смывом из носоглотки больного с подозре-

нием на аденовирусную инфекцию. Во флакон с полноценным монослоем кле-

ток над пламенем спиртовки вносят стерильной пипеткой вируссодержащую жидкость в объеме 0,1мл. Затем второй стерильной пипеткой добавляют во флакон 0,9мл среды 199 с бычьей сывороткой. Флаконы с зараженной культу-

рой клеток укладывают в штатив и ставят в термостат при 370С на 48-72 часа.

14

Занятие №2

Тема. Вирусологический метод диагностики. Интерфероны, классификация,

механизм действия, практическое применение. Особенности противовирусного иммунитета.

Цель занятия. Освоить принципы индикации и идентификации вирусов.

Изучить особенности противовирусного иммунитета.

I.Теоретические знания:

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентификации вирусов.

2.Интерфероны, классификация. Механизм действия. Практическое примене-

ние.

3.Особенности противовирусного иммунитета

II.Практические навыки:

1.Провести вскрытие куриного эмбриона и взятие вируссодержащей алланто-

исной жидкости.

2.Определить наличие вируса гриппа в аллантоисной жидкости куриного эм-

бриона с помощью реакции гемагглютинации.

3.Провести идентификацию вируса гриппа в реакции торможения гемагглюти-

нации.

4.Провести учет цитопатогенного действия аденовирусов на культуру клеток.

5.Провести идентификацию аденовирусов с помощью реакции нейтрализации

вкультуре клеток.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентифи-

кации вирусов.

Методы индикации вирусов

Индикацию (обнаружение) вирусов в материале от больного проводят

различными способами. Они зависят от метода культивирования вируса:

Если вирус способен размножаться в курином эмбрионе, то для его обна-

ружения используют реакцию гемагглютинации (РГА). Она основана на спо-

собности таких вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты с помощью фермента «гемагглютинина», расположенного в суперкапсиде вируса. В ре-

зультате реакции in vitro наблюдается осадок эритроцитов в виде «перевернуто-

го зонтика» – это положительный результат РГА. При отрицательной реакции – выпадает осадок эритроцитов с ровными краями. Используют для индикации

вирусов гриппа.

Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток, можно прово-

дить по их цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рисунок 5). Это дей-

ствие выражается в повреждении монослоя зараженной культуры клеток и из-

менении их морфологии: клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение

монослоя. Используют для индикации аденовирусов. а) б)

Рисунок 5 – Культура клеток: нормальная (а), дегенерированная (б)

2

Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных живот-

ных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства.

Методы идентификации вирусов

Идентификацию вирусов проводят по антигенным свойствам с помощью серологических реакций со специфическими диагностическими противовирус-

ными сыворотками. Основными реакциями являются: реакция торможения ге-

магглютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток или в организме жи-

вотного, реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ

(ИФА).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА): 2-компонентная, слож-

ная серологическая реакция.

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: 1% взвесь эритроцитов.

Постановка реакции: готовят разведения диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины. К ним добавляют вируссодержащую жид-

кость и оставляют на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем в лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции проводят через 1-2 часа.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин блокируется антителами сыворотки, поэтому агглюти-

нация эритроцитов отсутствует. Визуально в лунках определяется осадок

эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин склеивает эритроциты. Визуально в лунках определяет-

ся осадок эритроцитов с неровными краями в виде «перевернутого зонти-

ка».

РТГА применяют для идентификации вирусов гриппа и других вирусов,

имеющих в суперкапсидной оболочке фермент гемагглютинин.

3

Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток: 2-компонентная,

сложная серологическая реакция.

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: культура клеток.

Постановка реакции: вируссодержащую жидкость смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сыворотками. Оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем содержимым пробирок заражают культуры кле-

ток во флаконах.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Про-

исходит нейтрализация вируса антителами сыворотки и культура клеток оста-

ется нормальной, без изменений.

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-

рус оказывает цитопатогенное действие, что приводит к дегенерации культу-

ры клеток.

РН в культуре клеток применяют для идентификации вирусов полиомие-

лита, аденовирусов и др.

РН можно также использовать для идентификации вирусов, культи-

вируемых в организме лабораторных животных. Компоненты и постановка реакции такие же, как в РН в культуре клеток. Индикатор реакции: лаборатор-

ное животное (в частности, белые мыши).

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу диагностической сыворотки, происходит его нейтрализация антителами сыворотки и животное

остается здоровым.

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки, жи-

вотное погибает.

РН в организме животного используется для идентификации вирусов бе-

шенства.

В таблице 2 представлены обобщенные данные о методах культивирова-

ния, индикации и идентификации вирусов.

4

Таблица 2 – Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

2. Интерфероны, классификация, механизм действия, практическое при-

менение

Интерфероны – гликопротеины, которые вырабатываются многими клет-

ками организма. Однако эта способность наиболее выражена у лейкоцитов,

фибробластов и лимфоцитов. Интерфероны (ИФ) являются цитокинами, подав-

ляющими размножение вирусов, определенных бактерий и некоторых раковых клеток.

По природе клеток, вырабатывающих ИФ, их делят на три группы: α-ИФ (лейкоцитарный): обладает выраженным противовирусным дейст-

вием;

β-ИФ (фибробластный): обладает противовирусным действием, а также регулирует работу лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (иммуномо-

дулирующее действие);

γ-ИФ (иммунный): продуцируется всеми Т-лимфоцитами, стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, фагоцитов, усиливает синтез молекул MHCI и

MHCII и др. Таким образом, γ-ИФ усиливает активность всех звеньев им-

мунной системы.

Механизм противовирусного действия интерферонов.

Интерфероны ингибируют внутриклеточную репликацию широкого спек-

тра ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

Винфицированной клетке синтезируется ИФ, выходит из нее, связывается

споверхностью здоровой клетки и индуцирует в ней синтез антивирусных бел-

ков. Если в эту клетку проникает вирус, то его репродукция подавляется этими

белками. Один из них является ферментом рибонуклеазой, которая разрушает

5

мРНК вируса. Второй фермент – протеинкиназа – блокирует синтез вирусных белков. Репродукция вируса становится невозможной.

Практическое использование интерферона для лечения и профилактики вирусных инфекций связано с использованием препаратов на основе генно-

инженерного рекомбинантного α2-ИФ. Его получают в культуре бактерий по-

сле встраивания в их геном гена человеческого α-ИФ. Рекомбинантный α2-ИФ эффективен для лечения хронических гепатитов В и С, герпетической и папил-

ломавирусной инфекции.

3. Особенности противовирусного иммунитета.

Интерфероны (гликопротеины) продуцируются клетками при вирусной ин-

фекции. Являются первой, наиболее ранней линией защиты (через несколько часов после начала размножения вируса).

Основными клетками, осуществляющими в организме противовирусный им-

мунологический надзор, являются ЦТЛ и NK-клетки. Они разрушают инфи-

цированные вирусом клетки с помощью перфоринов и гранзимов.

Т-лимфоциты и интерфероны приводят организм к выздоровлению, но не формируют приобретенного иммунитета.

Противовирусные антитела (секреторные IgA и сывороточные IgM и G) за-

щищают только при внеклеточном расположении вирусов. Окружая вирио-

ны, они препятствуют их адсорбции на клетке.

Гуморальное звено защиты формирует приобретенный (постинфекцион-

ный) иммунитет за счет клонов клеток памяти из В-лимфоцитов.

Развитие вирусной инфекции всегда подавляет некоторые защитные меха-

низмы (незавершенность фагоцитоза, подавление синтеза молекул MHC I

класса на поверхности зараженных клеток, подавление активации компле-

мента по классическому и альтернативному пути и т.д.).

6