ПРОГРАМИРОВАННЫЯ ГИБЕЛЬ КЛЕТКИ.
ТЕЛОМЕРЫ И ТЕЛОМЕРАЗА
1.1.Теломеры и теломераза
Теломеры – концевые участки хромосом, которые не несут генетической информации. Теломеры служат для защиты генетического материала хромосом от потерь при репликации и от атак эндонуклеаз.Теломеры на концах ДНК эукариотических хромосом были открыты в 1938 г. Барбарой Мак-Клинтон и Гарманом Мюллером независимо друг от друга. Они установили, что концевые участки ДНК (или хромосом)
являются достаточно стабильными структурами, остающимися неизменными, даже при значительных нарушениях генетического аппарата.
При их экспериментальном удалении идет слияние хромосом и их деградация. Теломеры не несут генетической информации.
При репликации молекул ДНК возникает проблема репликации концов (т.е. теломеров). После завершения репликации хромосомы и удаления концевого праймера (или РНК-затравки) 5 -концы дочерних цепей ДНК остаются недостроенными, т.е. образуется незаполненная брешь. Это происходит потому, что ДНК-зависимая ДНК-полимераза III не может вести синтез концевого участка цепи от 5 - к 3 -концу. Эта брешь заполняется теломерами, которые синтезируются ферментом теломеразой.
Теломераза в качестве простетической группы использует концевую РНК-затравку, которая служит матрицей при синтезе теломер.
Теломераза присоединяет нуклеотид за нуклеотидом к 3 -концу вновь синтезированной дочерней нити ДНК. Теломеры состоят из многократно повторяющихся фрагментов олигонуклеотидов.
Рис.3.1. Схема синтеза теломер
Во время деления клетки теломеры теряют от 5 до 20 фрагментов, и с каждым делением становятся короче. Последовательное исчезновение концевых участков приводит к потере генов. Укорочение до определенной
критической длины становится сигналом к прекращению деления. Обычно клетки имеют 20-90 делений (у новорождённых – 80-90 делений, а клетки 70-
летних делятся только 20-30 раз).
Определённое число клеточных делений называют порогом
(лимитом) Хейфлика. Поэтому уровень активности фермента в соматических клетках обеспечивает быструю или медленную степень старения или степень роста. В раковых клетках и в зародышевых клетках число делений не ограничено за счёт высокой активности теломеразы. В
большинстве соматических клеток теломераза неактивна, т.к. эти клетки имеют длину теломерной ДНК, достаточную для времени жизни её потомства. Активность теломеразы в физиологических условиях обнаруживают в клетках с высокой скоростью обновления, таких как лимфоциты, стволовые клетки костного мозга, клетки эпителия, эпидермиса кожи,эмбрион.
Биохимический анализ, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет не только определить наличие в исследуемом материале клеток опухоли, но и очень часто определить прогноз её развития.
Решением проблемы является поиск и внедрение в клиническую практику онкомаркеров, которые являлись бы характерными для большинства опухолей, т.е. универсальными. Одним из наиболее перспективных, универсальных онкомаркеров является теломераза. Этот уникальный для человеческого организма фермент – обратная транскриптаза – является ключевым в поддержании стабильности генетического аппарата клетки в процессе многократного ее деления. При наступающем укорочении теломер белок освобождается и активирует транскрипцию митотического репрессора.
Теломераза может играть роль звена в регуляции процессов гибели клеток. Присутствие теломеразы в клетке обусловливает репрессию синтеза теломер-связывающих белков. Необходимо вспомнить, что теломеры принимают участие в поддержании жизненно важных процессов в клетке:
защищают хромосомы от рекомбинации и деградации, распознавания их, как поврежденной ДНК; играют одну из главных ролей в фиксации хромосом в ядре; участвуют в регуляции экспрессии различных генов и служат механизмом, контролирующим число делений клетки и ее запрограммированную гибель (апоптоз).
1.2.Теломерный комплекс
Уживотных и человека на концах линейных хромосом расположены тысячи консервативных повторов гексодезоксинуклеотидов -ТТАGGG,
называемых теломерами, которые позволяют концам хромосом прикрепляться к ядерной оболочке, предотвращают их разрушение и рекомбинации. При каждой репликации длина теломер укорачивается примерно на 120 пар оснований – это явление характерно для соматических
(в норме не делящихся клеток, не опухолевых и не эмбриональных клеток).
Для соматических клеток при их репликации такое укорочение теломер служит репликометром, т.е. теломеры должны укоротиться до критического размера, чтобы клетка потеряла способность делиться, стареть и подвергаться апопотозу. Иными словами, этот процесс не даёт возможности клетке превратиться в онкологическую, т.е. постоянно делящуюся
(бессмертную).
Если клетка имеет повреждённую ДНК с её теломерами, должны включиться ген апоптоза Р-53, чтобы такая клетка погибла и не стала бессмертной.
Итак, теломеры состоят из многократно повторяющихся фрагментов олигонуклеотидов. Во время деления клетки теломеры теряют от 5 до 20
фрагментов, становясь короче с каждым делением. Последовательное исчезновение концевых участков приводит к потере генов. Укорочение до определенной критической длины становится сигналом к прекращению деления.
Строение теломерного комплекса. Теломерсвязывающие белки
(TelomereBindingProteins)
Белки, связывающие теломеры, у млекопитающих представлены двумя белками (telomerrepeatfactor 1 и 2 – TRF1 и TRF2).
Впервые представители этого семейства белков были выделены из дрожжей Saccharomycescerevisiaea. Затем они были обнаружены в человеческих клетках. Эти белки обладают ДНК-связывающими доменами.
Белок TRF1 – регулятор длины теломер, с этим белком взаимодействует белок TYN2 и танкираза.
Танкираза
ТанкиразаPARP – фермент, связанный с белком теломерного комплексаTRF1.
Белки теломерного комплекса защищают от доступа теломеразы,
однако эта защита может нарушаться при помощи танкиразы. Повышение экспрессии в клетках ведет к постепенному удлинению теломер и открытию доступа теломер для теломеразы. Активность танкиразы характерна для раковых клеток. Действие танкиразы аналогично действию дифтерийного токсина, т.е. нарушение функции белков путем их АТФ-рибозилирования.
Белок TRF2 связан с конечным фрагментом теломеры, защищающего от ферментов репарации ДНК (репарация – восстановление повреждения):
ДНК-фотолиазы, ДНК-N-гликозидазы, ДНК-инсертазы, эндонуклеазы, ДНК-
зависимой ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы. Потеря этого белка приводит к остановке клеточного цикла и слиянию хромосомы и Р-53-опосредованному апоптозу.
Т.о.,теломеры ДНК связаны с белками TRF1 и TRF2, что не позволяет теломерам укоротиться до гибели ДНК, но и не позволяет делиться,
превращая клетку в опухолевую. Если комплекс теломер с этим белком разрушается – это приводит к остановке клеточного цикла. Включается ген Р-53 – это ведёт к апоптозу, что не позволяет развиваться опухолевым
процессам. Поэтому организму необходимо поддерживать баланс между появляющимися и отмирающими клетками.
1.3.Теломераза
Существует понятие «активная теломераза»,её активность приводит к клеточному бессмертию, индуцируя постоянное клеточное деление,
информация об активной теломеразе является универсальным маркером онкологических процессов.
Иммортализация – процесс, ведущий к приобретению клеткой способности делиться неограниченное число раз, не вступая в процесс апоптоза.
Клетки опухоли обязательно должны пройти иммортализацию,
обойдя запрограммированную гибель – апоптоз, наступающий в результате критического укорочения теломер. Т.о. активная теломераза → имортализация (бессмертие) → опухоль.
В норме, в соматической клетке укорочение теломер – это регулятор клеточной пролиферации, поддерживающий уровень делящихся и стареющих клеток.
Клетка перестает делиться и подвергается апоптозу, когда укорочение теломер становится критическим – это называется лимитом Хейфлика, т.е.
это максимальное укорочение теломер, не приводящее к апоптозу, но останавливающее пролиферацию.
Время существования культуры соматических клеток конечно и определяется количеством делений (≈ 60). Барьер в 60 делений преодолевают в норме стволовые клетки. Леонард Хейфлик установил это в 60-х гг. XX в.
Т.о. образуется следующий механизм:
1.Старая клетка (или с поврежденной ДНК) → больше коротких теломер → апоптоз → лимит Хейфлика преодолен.
2.Нормальные клетки – уровень размера теломер контролируется, не преодолевая критического укорочения (лимита Хейфлика).
3. Опухолевая клетка –нет клеток с укороченными теломерами, клетка не отмирает, а постоянно размножается. Нет лимита Хейфлика.
В 1971 г. А.Оловников предложил теломерную гипотезу старения
(укорочения теломер, ведущую к апоптозу) и высказал предположение о наличии специализированной ферментной системы, контролирующей и поддерживающей длину теломер ДНК.
Фермент, способный увеличивать длину теломерных последовательностей ДНК, был выделен Э.Блекберном и Э.Грейдером в 1984
г. из культуры жгутиковых простейших Tetrahynemathermophilia. Этот фермент был назван теломеразой (telomere – terminaltransferase).
Теломераза – это фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК (TTAGGG) – к 3 -концу цепи ДНК на участках теломер.
Теломераза экспрессируется в тех клетках, которым необходимо постоянно делиться. В норме это стволовые, половые клетки, клетки эпителия кишечника. Обычные соматические клетки лишены теломеразной активности. Опухолевая клетка обладает активной теломеразой.
Строение теломеразы
Это уникальный фермент – обратная транскриптаза – рибонуклеопротеид – 2 субъединицы, содержит РНК-компонент, матрицу,
называемую (TERC) – теломеразная РНК. Это шаблон, с которого считывается информация, располагается на 5 -конце теломеразы, она связана с её каталитической субъединицей (TERТ) – собственно обратной транскриптазой. Т.о. этот фермент сам себя обслуживает и считывает информацию; обратная транскриптаза создаёт одноцепочечную ДНК на основе РНК-матрицы в процессе репликации ДНК (это РНК-зависимая ДНК-
полимераза).
Рис.3.2. Строение теломеразы
TERТ – каталитическая субъединица – теломеразнаяобратная транскриптаза (telomerasereversetranscriptase). Сама TERТ состоит из структурного белка и функционального (каталитического).
I. Структурные компоненты TERТ (белки).
1. Человеческий белок Р-95 обладает якорным сайтом и фиксирует 3 -
концевой участок теломера ДНК.
2. Белок осуществляет связь с РНК-матрицей (TERC) – теломеразы и связан с функциональным (каталитическим) компонентом TERТ. Второй белок структурного компонента TERТ называют «связывающим».
II.Функциональный (каталитический) белок TERТ – называют hTERТ
–белок Р127, продуцирует белок с М.м. 127 кДа.
Сама TERТ – обратная транскриптаза имеет форму рукавицы или шпильки, что позволяет ей закрепляться на 3 -конце ДНК и добавлять в неё одноцепочечные теломерные повторы, используя свою РНК-матрицу
(TERС).
Активность теломеразы в клетке наблюдается в основном в S-фазу клеточного цикла, когда осуществляется репликация ДНК. Теломеры при этом частично освобождаются от теломер-связывающих белков, обеспечивая теломеразе доступ к ДНК. После завершения репликации белково-
теломерные комплексы образуются заново.
Удлинение теломер происходит в 3 основных этапа:
1 .Связывание.Теломерная последовательность ДНК связывается в специфическом якорном сайте белка Р95.
2.Элонгация. Во время этой стадии происходит достройка 3 -конца теломеры на матрице РНК, в результате чего матричный участок РНК оказывается полностью связанным с ДНК. Эта реакция катализируется обратно-транскриптазной субъединицей теломеразы (TERТ).
Рисунок 3.3. Работа теломеразы.Цифры в рамках обозначают положение теломеразы по отношению к праймеру (3′-концу ДНК теломеры) на различных стадиях: 1 - фермент не связан с праймером; 2 - отжиг праймера; 3 - стадия элонгации; 4 - завершение присоединения одного теломерного повтора. Пунктирными стрелками показаны возможные процессы диссоциации праймера при работе фермента. Условные обозначения: TERT — белковая субъединица с сайтом «заякоривания» теломерной ДНК (серый кружок),TERC — теломеразная РНК с матричным участком (серый прямоугольник).
3. Транслокация. Происходит перемещение фермента вперед по теломерной ДНК. В результате этого оказывается свободной часть матричного участка РНК впереди 3 -конца теломеры. Далее стадии повторяются, в результате чего 3 -конец теломерной ДНК удлиняется на определенное число теломерных повторов.
Достройки только 3 -конца теломеры недостаточно для нормального ее восстановления, т.к. ДНК является двухцепочечной молекулой. Достройка
5 -конца теломерной ДНК происходит уже без участия теломеразы также в S-
фазу клеточного цикла, обычным путём. К вновь синтезированным теломерным повторам присоединяются РНК-праймерыОказаки.
Достройка осуществляется в основном двумя методами.
1. Синтез обычным способом. При этом к вновь синтезированным теломерным повторам присоединяются РНК-праймеры и происходит синтез фрагментов Оказаки. Далее ДНК-полимераза β вырезает праймеры, ДНК-
лигаза сшивает фрагменты, т.е. осуществляется синтез отстающей цепи, как при репликации. Важно отметить, что небольшой 3 -оверхенг при этом остается.
2. Образование «шпильки». Это достаточно редко встречающийся способ. Длинный 3 -конец теломеры при этом образует небольшую петлю, и
она служит началом для синтеза новой цепи ДНК, комплементарной вновь синтезированным теломерным повторам. Синтез 5 -конца теломеры завершает её удлинение.
Иммортализация – процесс, ведущий к приобретению клеткой способности делиться гипотетически неограниченное число раз, не вступая при этом в процесс апоптоза. Нормальный тканевый цикл регулируется большим количеством многоуровневых механизмов, поэтому иммортализацияinvivo практически всегда сопряжена с мутациями в геноме и изменениями в фенотипе клетки и во многих случаях приводит к появлению новообразований. Клетки опухоли обязательно должны пройти через процесс