Основные моменты

Секвенирование - определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК путём получения серии комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. Является последним этапом молекулярного анализа предварительно отобранного, клонированного и протестированного более простыми методами фрагмента ДНК.

Цели:

-расшифровка генома – определение количества генов, их протяжённости, локализации, функций;

-идентификация неизвестных микроорганизмов путём сравнения нуклеотидной структуры некоторых их генов с соответствующими последовательностями известных видов;

-определение мутаций в генах для выявления резистентных микроорганизмов и изучения молекулярных механизмов устойчивости;

-эпидемиологические исследования (определение генетических различий штаммов одного вида, выделяемых в разное время и из разных источников для определения связей между циркулирующими в различных регионах и стационарах микроорганизмов);

-оценка сходства микроорганизмов и их происхождения.

Методы секвенирования

Метод Сэнгера Метод Максама-гилберта

Автоматическое секвенирование Метод Роберта (пиросеквенирование) Полони-секвенирование Секвенирование с помощью нанопор Полупроводниковое секвенирование Метод Illumina/Solexa

и много других методов

Секвенирование по Сэнгеру

Первый метод, используемый для обработки целых геномов, который появился в 60-х годах прошлого века. Смысл: участок ДНК клонируется, после чего полученная смесь делится на четыре части. Каждая часть помещается в активную среду, где присутствуют:

1) ДНК-полимераза, которая занимается репликацией

2) праймеры, необходимые для начала процесса репликации

3) смесь всех четырёх нуклеотидов, которые будут служить «кирпичиками» для строительства новых копий ДНК

4) и специальные вариации одного из нуклеотидов (ровно один вид нуклеотидов для каждой части), которые прекращают дальнейшее копирование молекулы ДНК.

Определение длины каждой копии позволяет установить положение данного мономерного звена в цепи исследуемого полинуклеотида. Длина копии определяется фракционированием в полиакриламидном геле. Этот метод позволяет получать информацию о положении определенного мономерного звена в цепи полинуклеотида прямо после

фракционирования.

Сэнегер «плюс-минус»

Для получения копии исследуемого полинуклеотида в последнем выбирают точку отсчёта, что достигается введением в систему ферментативного синтеза в качестве нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такой олигонуклеотид во всех копиях, образующихся в результате достраивания его ферментативным путём, остается постоянным 5'-концевым фрагментом, т. е. является точкой отсчёта. Копирование с помощью ДНК-полимеразы в присутствии всех четырёх дезоксирибонуклеозид-5'-пирофосфатов (один из них берется 32Р-меченным) проводят в течение ограниченного времени. Цель этого этапа - проведение статистически ограниченного синтеза для получения всех возможных копий, начиная с затравки, достроенной на одно, два и т. д. звеньев, и включая полную копию изучаемого полинуклеотида. В идеале смесь должна включать все возможные полинуклеотиды. На практике различные компоненты смеси присутствуют в разных количествах. Если такую смесь далее подвергнуть электрофорезу в полиакриламидном геле в определенных условиях, когда скорость движения пропорциональна длине цепи, на электрофореграмме

Сэнегер «плюс-минус»

Инкубационную смесь 32Р-меченных олигонуклеотидов различной длины в виде комплексов с матричным полинуклеотидом подвергают гель- фильтрации для удаления дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов и аликвоты реакционной смеси реинкубируют с ДНК-полимеразой в различных условиях. В случае "минус-системы" реинкубацию проводят в присутствии только трёх дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов. Например, в «- А-системе» отсутствует dATP и каждая копия в смеси достраивается с помощью ДНК-полимеразы до места, в котором следующим мономерным звеном должен быть остаток pdA. Образующуюся смесь фракционируют с помощью электрофореза и обнаруживают ограниченное количество полос. Аналогично проводят копирование в отсутствие других субстратов: - dGTP, - dCTP или - dTTP. Все четыре ионофореза проводят в полиакриламидном геле параллельно. Полученные ауторадиограммы позволяют сразу написать нуклеотидную последовательность, причем чтение цепи снизу вверх соответствует 5' 3'- полярности цепи копии.

Соответствующий участок цепи в матрице читается с учетом принципа комплементарности и антипараллельности цепей в комплексе матрица - затравка. Для проверки этих данных используют результаты анализа с помощью "плюс-системы". В этом случае дополнительное копирование (после первого этапа) проводят в присутствии ДНК-полимеразы, выделенной из бактериофага Т4, которая в отсутствие субстратов (нуклеозид-5'-трифосфатов) проявляет 3'-экзонуклеазную активность, т. е. отщепляет мононуклеотиды один за другим с 3'-конца. В то же время в присутствии субстратов ее полимеразная активность во много раз превосходит экзонуклеазную. Так, если в реакционной смеси присутствует хотя бы один дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в " +А-системе"), деградация каждой копии, образовавшейся на первой стадии анализа, будет проходить вплоть до места положения А. В этом случае pdA включается много быстрее, чем удаляется, и, таким образом, накапливаются фрагменты, содержащие на 3'-конце цепи А. Аналогично проводят копирование в присутствии только dGTP, dCTP или dTTP. Смеси параллельно подвергают электрофорезу, как и в предыдущем случае, и

Сэнгер «терминанты»

В 1977 Сэнгер предложил ещё один способ ферментативного секвенирования, получивший название метода терминирующих аналогов трифосфатов. Более мощный и более технологичный, этот способ применяется до сих пор. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырёх типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) ещё и одного из 2',3'-дидезокси-нуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по

расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.

Сэнгер «терминанты»

Метод Максама-гилберта

В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. В 1977 г. Максамом и Гилбертом был предложен метод секвенирования, основанный на селективной химической модификации различных типов гетероциклических оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований проводятся таким образом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем модифицировалось только одно звено данного типа. Поскольку все звенья данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажется частично модифицированным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению модифицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах отщепления гетероциклов. Модификации подвергают ДНК, 32Р-меченные по 5'-концевому